[发明专利]一种含吡啶和吗啉基团的双质子化位点的pH荧光探针、制备方法和应用

权利要求书

1.一种pH荧光探针，其特征在于，该探针含有两种质子化位点，分别为吗啉基团和吡啶基团，所述吗啉基团质子位点连接在萘酰亚胺基团上并通过长链烷基链与由二苯乙烯发色团和所述吡啶基团为主的质子识别位点连接，其结构通式(I)所示：

2.根据权利要求1所述的pH荧光探针，其特征在于：所述的pH荧光探针的pH响应区间为3.1-5.0。

3.根据权利要求1所述的pH荧光探针，其特征在于：所述的pH荧光探针的pKa为4.05。

4.一种权利要求1所示的pH荧光探针的制备方法，其特征在于，按以下步骤操作：

(1)将等当量4-溴-1,8-二萘酐、4-(2-氨乙基)吗啉分散在适量甲醇中，回流条件下反应8h，冷却至室温后，过滤得淡黄色的沉淀，得中间体1；

(2)在单口烧瓶中，依次加入中间体1、甲醇钠和无水甲醇，在回流条件下反应36h，抽滤，滤饼用浓度为10％的稀盐酸洗涤，然后水洗，得中间体2；

(3)在回流条件下，中间体2和浓度为57％的浓HI酸，反应6h，冷却至室温，用碳酸氢钠稀溶液中和至pH 7-8，过滤得黄色固体中间体3；

(4)在单口烧瓶中，依次加入一当量3,5-二甲基-4-羟基苯甲醛、10当量1,6-二溴己烷、碘化钾、无水碳酸钾和N,N-二甲基甲酰胺，加热到100℃反应12h；用乙酸乙酯萃取，旋蒸有机相除去溶剂，得到粗产品，再经硅胶柱层析得到中间体4；

(5)将中间体3、中间体4、碘化钾、无水碳酸钾和N,N-二甲基甲酰胺加入到单口烧瓶中，加热到100℃反应12h；反应结束后，反应液倒入到去离子水中，用乙酸乙酯萃取，旋蒸有机相除去溶剂，得到粗产品，再经硅胶柱层析得到中间体5；

(6)向烧瓶中加入甲基三苯溴化磷和四氢呋喃，冰浴下分三次加入叔丁醇钾，在持续通氮气的条件下搅拌15min；将中间体5加入到反应体系中，冰浴下搅拌10min；置于室温下反应4h；反应结束后，反应液倒入到去离子水中，用乙酸乙酯萃取，旋蒸有机相除去溶剂，得到粗产品，再经硅胶柱层析得到中间体6；

(7)向烧瓶中依次加入2,4'-二溴苯乙酮、六次甲基四胺和三氯甲烷，室温下搅拌反应24h，过滤，取固相烘干得白色固体；取白色固体，在0℃条件下分散在乙醇中，搅拌下分次加入浓盐酸，然后在0℃条件下搅拌反应1h，再置于室温反应24h；反应结束后，抽滤除去白色沉淀物，取滤液，旋干得中间体7；

(8)在三口烧瓶中，依次加入中间体7、异烟酸和三氯氧磷，回流条件下反应6h；反应结束后，冷却至室温，旋蒸掉剩余的三氯氧磷， 向烧瓶内加入乙醇：水＝2:1(v/v)的混合液体，使其全部分散在液体中，以质量比为20％的氢氧化钠水溶液调节溶液的pH至10左右，用二氯甲烷萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥后过滤，将滤液旋蒸后得粗产物，用柱层析法提纯得到中间体8；

(9)在三口烧瓶中，依次加入中间体8、中间体6、无水碳酸钾、双(三苯基膦)二氯化钯和25mL N,N-二甲基甲酰胺，加热到160℃，氮气氛围下反应24h，冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，用乙酸乙酯作为展开剂，经硅胶柱层析法提纯得到目标荧光探针分子。

5.权利要求1、2或3所述的pH荧光探针在检测生理体系pH中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，荧光探针在检测活细胞内pH的应用。