[发明专利]一种含吡啶和吗啉基团的双质子化位点的pH荧光探针、制备方法和应用

说明书

本发明提供一种含吡啶和吗啉基团的双质子化位点的pH荧光探针、制备方法和应用，其中探针的结构由下式(I)表示。该探针在pH3.1‑5.0范围呈现较宽的pH响应，且该探针的pKa为4.05，此外该探针还具有较好的水溶解性，光、化学稳定性、较好的离子选择性和生物兼容性。荧光显微成像实验表明这种探针具有较好的细胞通透性和pH响应性，对细胞毒性很小。

【技术领域】

本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种用于特异性检测水相中pH值的荧光探针及其制备方法及该荧光探针在生物活细胞检测中的应用。

【背景技术】

作为一个重要的新陈代谢及细胞内的参数，氢离子浓度在许多细胞过程中起到关键的调节作用，比如细胞生长、钙离子调节、酶活性、信号传导、细胞内吞作用、化学向性及其他的细胞过程。人体最佳的pH值是在7.35-7.45左右,呈弱碱性,因为这时的细胞活性最强,器官运行最正常。如果pH值低于7.35，则人体细胞、各种酶和激素活性将大受抑制,组织器官功能下降,人体免疫降低,会引发各种疾病(Fluid&electrolytes:physiology&pathophysiology.)。另外,有一些细胞器内部的正常即为酸性,在4-6之间，如核内体和植物液泡。在细胞生物学中,在pH值为7.0时,蛋白质变性或酶和蛋白质功能作用缓慢,低pH值可起到使蛋白质变性或激活酶和蛋白质功能的作用。例如,溶酶体中的酸性环境(pH 4.5-5.5)，可以促进蛋白质在细胞代谢过程中的降解。许多报道认为一些疾病如癌症、肾衰竭、肺病等与细胞质或者酸性细胞器内的pH异常有关。因此，细胞内pH的精确测量是非常重要的。

目前，许多方法可用于检测pH。比如微电极、核磁、吸收及荧光光谱方法。在这些方法中，荧光法由于其非入侵的性质、高的灵敏度和专一性，以及广泛可用的荧光染料在测定pH时比其他方法更为优越。而且，荧光显微成像技术通过使用荧光pH探针能够捕捉到细胞内氢离子的时空分辨。

通常，两类适用于不同pH范围的pH荧光探针的报道较多。一类如下式所示的探针a(J Am Chem Soc.2007；129:1894-1895)和b(Org Lett.2004；6:2757-2760)被用于细胞质中，适用于pH范围在6.80-7.40，还有一类如探针c(New J Chem.2010；34:656)，被用于酸性细胞器(如溶酶体)中，使用pH范围为4.50-6.00。

理想的荧光探针应当灵敏的响应细胞内pH的微小变化，并且能够避免来自细胞生物本身的干扰。然而，目前可用的pH荧光探针有以下缺点：低的灵敏度，有的激发在紫外区。激发在紫外区能够损伤组织样品并且引起生物样品自发荧光的干扰。另外，用于检测酸性器官内的理想的pH探针较少，这被认为是细胞生物学及医学发展的瓶颈。

【发明内容】

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有高的灵敏度、好的离子选择性、好的光稳定性以及工作pH在酸性范围、适用于检测细胞内氢离子的荧光探针。

本发明解决问题采取的技术方案为，一种采用荧光法对环境或细胞内pH检测的荧光比率荧光探针，其分子结构式如下式(I)：

具体合成方法如下：

(a)在250mL单口烧瓶中，依次加入4-溴-1,8-二萘酐(15g，54mmol)、4-(2-氨乙基)吗啉(7g，54mmol)和150mL甲醇，在回流条件下反应8h，冷却至室温后，过滤，干燥，得化合物1，淡黄色固体，17g，产率81.0％。

(b)在250mL单口烧瓶中，依次加入产物1(15g，38.5mmol)、甲醇钠(0.21g，3.9mmol)和150mL无水甲醇，在回流条件下反应36h，抽滤，滤饼用稀盐酸(10％)洗涤，然后水洗，干燥得化合物2，黄色固体，10.9g，产率83.2％。