[发明专利]Glypican‑1蛋白在胰腺癌诊断中的应用、阳性外泌体浓度的检测方法及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种Glypican-1蛋白在胰腺癌诊断中的应用、Glypican-1阳性外泌体浓度的检测方法及其用途。

背景技术

胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率近年来明显上升。据美国临床肿瘤协会统计，全球男性胰腺癌患者病死率居恶性肿瘤的第8位，女性患者居第9位，胰腺癌患者5年生存率始终低于5%。更糟糕的是，胰腺癌早期并没有明显的征兆，病程短且发展快。80%的胰腺癌患者确诊后生存时间不超过1年。

目前，CA19-9水平是唯一一个临床接受的胰腺癌标志物，但其用途有限，因为它被认可仅用于监测胰腺癌进展或对治疗的反应，但不用于胰腺癌诊断或分期。另外，血清CA19-9水平可以区分健康人群和胰腺癌患者，但某些胰腺良性疾病亦可导致CA19-9的升高，这样，就大大降低了该指标对于诊断胰腺癌的敏感性与特异性。

现今，外泌体作为可诊断疾病的生物标志物越发受到关注。肿瘤来源的外泌体上含有的某些特异的蛋白质，对于肿瘤的诊断有着特殊的意义。然而现在大多数测定外泌体的方法都需要先对血液中外泌体进行提取后再检测，所需样品量大，并且耗时，低通量，价格昂贵，不足以应用于临床。纳米等离子体增强散射（nPES）测定法能直接从微量血浆中量化肿瘤衍生的外泌体，而无需经过提取、鉴定等繁杂过程。并且通过识别某些特异性抗原，使得外泌体诊断肿瘤之路简便许多。

目前，国际上还没有关于nPES测定外泌体含量的报道，也没有Glypican-1蛋白对于胰腺癌诊断的价值评估，因此，纳米等离子体增强散射法检测Glypican-1阳性外泌体浓度的提出和Glypican-1蛋白的发现，填补了这方面的缺陷。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种Glypican-1蛋白在胰腺癌诊断中的应用、Glypican-1阳性外泌体浓度的检测方法及其用途，采用的纳米等离子体增强散射（nPES）测定法是一种灵敏、特异又简便的血浆中胰腺癌相关外泌体的量化方法，结合胰腺癌来源外泌体上特异的蛋白—Glypican-1，可用于胰腺癌的诊断和分期。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种Glypican-1蛋白的用途，用于制备诊断胰腺癌的产品。

其中，所述产品为芯片、检测试剂或检测试剂盒。

进一步，所述芯片包括蛋白芯片，所述检测试剂盒包括蛋白免疫检测试剂盒。

本发明实施例还提供一种Glypican-1阳性外泌体浓度的检测方法，为纳米等离子体增强散射方法。

其中，所述纳米等离子体增强散射方法所用检测试剂包括以下组成：

（Ⅰ）氨基功能化的玻璃载片（NH₂玻璃）、甲醇、氮气（N2）流、50孔聚二甲基硅氧烷膜（PDMS）；

（Ⅱ）磷酸盐缓冲洗涤液（PBS），pH值为7.4，其成分为：140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄；

（Ⅲ）封闭液为含5%牛血清蛋白（BSA）的PBS，pH值为7.4，其成分为：PBS，5%BSA；

（Ⅳ）羧基功能化的金纳米颗粒（GNP）：50nm金纳米球（辐射绿光）、25×60nm金纳米棒（辐射红光），当两者结合则信号加强并辐射黄光；

（Ⅴ）MES溶液，pH值为4.7，其成分为：2-（N-吗啉代）乙磺酸，用纯水配制；

（Ⅵ）浓度为5mM的EDC/PBS溶液、EDC / NHS溶液， EDC系羟基胶乳微球偶联抗体，成分为1-乙基-3-（3二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，浓度为2mg/ml；NHS，全称N-羟基琥珀酰亚胺，浓度为1mg/ml；

（Ⅶ）偶联缓冲液；

（Ⅷ）抗体溶液（抗体上携带羧基）：抗-CD63、抗-CD9、抗Glypican-1；浓度为0.5mg/ml；

（Ⅸ）标准品：已知质量的标准Glypican-1+exo样品溶解于无exosome的血浆中，浓度为1μg/ml，并稀释至所需浓度（30000，15000，7500，3750，1870，938，469和234 pg/所需）；

（Ⅹ）淬灭缓冲液：浓度为2mM的硫酸水溶液。