[发明专利]一种利用DNA甲基化抑制剂构建植物群体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用DNA甲基化抑制剂构建植物群体的方法。

背景技术

作为育种工作的物质基础，育种资源的丰富度直接决定良种选育的效率。当前，除了深入挖掘我国植物种质资源、规模化引进我国十分短缺又迫切需要的基因资源外，利用人工方法创造新的种质资源是解决育种资源匮乏、创造新的种质资源的有效途径。

目前人工方法创造新的植物种质资源主要包括诱变技术和转基因技术。与转基因技术相比，诱变技术虽然具有变化性状不可控、可能出现有害变化性状等缺点，但其同时也具有变化群体大、性状丰富等优点，通过选择，能够从变化群体中获得优良的种质资源。

诱变技术分物理诱变和化学诱变。物理诱变主要使用各种高能射线辐射诱导基因组发生变化。化学诱变是使用各种化学药剂诱导细胞发生变化，具有简单、高效、安全的特点。

DNA甲基化抑制剂是一种化学诱变剂，其中常用的为5-氮杂胞苷(5-azaC)。5-azaC是一类不改变基因组序列，但能使基因组甲基化水平降低的碱基类似物，能够诱导生物发生变化。甲基化变化后，能够导致相关基因的表达发生变化，引起一系列生理生化变化，从而使植物发生各种性状的变化(Chan et al.,2005；Zhang,2008)。研究发现，用甲基化抑制剂处理后，植物整体甲基化水平降低，能够诱发出一些新的性状。在小麦的研究中发现，用5-azaC处理能够促进其开花(Horváth et al.,2003)；5-azaC处理的小麦植株在分蘖数、分蘖率和千粒重均比对照高(陈芳和王子成，2011)。5-azaC处理的亚麻出现了矮化和早熟性状(Fiddes et al.,2005)。用5-azaC处理水稻能使其对白叶枯病的抗性得到提高(Akimoto et al.,2007)。

杨树属于杨柳科(Salicacae)杨属(Populus L.)植物，为多年生木本乔木，是重要的造林绿化树种和工业用材树种。优良的种质资源是杨树良种选育及杂交育种的必要材料。特别是欧洲黑杨(P.nigra)，仅在我国新疆北部地区有少量分布，基因资源相当匮乏(丁明明等，2008)。因此，亟待开发出一种创造优良杨树基因资源的方法。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，为进一步丰富杨树等林木种质资源，提供了一种利用DNA甲基化抑制剂构建植物群体的方法。该方法不仅能够创造新的种质资源，还能够为表观遗传学研究提供材料。

为此，本发明提供了一种利用DNA甲基化抑制剂构建植物群体的方法，其包括以下步骤：

1、外植体的选择、消毒预处理和培养；

2、无菌苗的扩繁；

3、无菌叶片的选择及预处理；

4、无菌叶片甲基化抑制剂处理；

5、再生芽的生根培养；

6、再生植株的温室移栽；

其中，所述DNA甲基化抑制剂为5-氮杂胞苷(5-azaC)。

在本发明优选的实施方案中，步骤1中外植体的选择是剪取半木质化的新发枝条，剪去叶片，清洗后，放入超净工作台；外植体的消毒预处理为剪取5cm左右的茎段，采用75％的酒精灭菌30秒，10％的次氯酸钠消毒8-10分钟，用无菌水冲洗外植体3次，灭菌滤纸吸干；外植体的培养是将消毒灭菌后的外植体接种在MS启动培养基中。

在本发明优选的实施方案中，步骤1中在对外植体进行培养之前，还包括在无菌条件下将外植体材料上与消毒剂接触过的界面进行切除的步骤。

在本发明优选的实施方案中，步骤2中无菌苗的扩繁是切取上述茎段外植体上生长的1-1.5cm高的芽，接种在生根培养基中，所述生根培养基为1/2MS+IBA0.01mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖25g/L+植物凝胶2.5g/L。

在本发明优选的实施方案中，步骤3中无菌叶片的选择是选择中上部完全展开的叶片；无菌叶片的预处理是在无菌条件下，用医用手术刀切去0.2mm左右的叶片边缘，并垂直于叶脉划3-4个0.5cm左右的伤口。

在本发明优选的实施方案中，步骤4中无菌叶片甲基化抑制剂处理是将划伤的叶片放置在添加不同浓度5-azaC的分化培养基上进行处理，5-azaC的浓度分别为0μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L、800μmol/L和1000μmol/L，分化培养基为MS+BA0.5mg/L+NAA0.03mg/L+蔗糖30g/L+植物凝胶2.5g/L。