[发明专利]唾液酸酶基因重组表达载体及其构建方法，唾液酸酶及其制备方法

权利要求书

1.一种唾液酸酶基因重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

制备唾液酸酶基因片段；

将所述唾液酸酶基因片段克隆到pMD-18T中，得到连接产物，将所述连接产物转化E.coliJM109,挑选阳性克隆子测序，获得如SEQ ID NO：1所示的基因序列；

将所述阳性克隆子和原核表达载体连接，得到所述唾液酸酶基因重组表达载体。

2.如权利要求1所述的唾液酸酶基因重组表达载体的构建方法，其特征在于，制备唾液酸酶基因片段的方法如下：

采用PowerLyzer^RPowersoil DNAisolation kit提取大王具足虫肠胃微生物基因组DNA作为模板进行聚合酶链式反应，得到所述唾液酸酶基因片段；其中，聚合酶链式反应采用的引物如下：

引物F：5’-GGATCCATGGAAAAATTAACAGGAATTTTTG-3’；

引物R：5’-GTCGACTTATGAAAGATATTTATCAATTATGTT-3’。

3.如权利要求1所述的唾液酸酶基因重组表达载体的构建方法，其特征在于，将所述唾液酸酶基因片段克隆到pMD-18T中的步骤前，还包括如下步骤：

将所述唾液酸酶基因片段用琼脂糖凝胶电泳检测，检测后用胶回收试剂盒进行纯化回收。

4.如权利要求1所述的唾液酸酶基因重组表达载体的构建方法，其特征在于，将所述阳性克隆子和原核表达载体连接的方法如下：

将所述阳性克隆子和原核表达载体分别经BamHI和SalⅠ双酶切后，电泳回收酶切片段，并用T4连接酶在16℃连接2h，得到所述唾液酸酶基因重组表达载体。

5.如权利要求1所述的唾液酸酶基因重组表达载体的构建方法，其特征在于，所述原核表达载体为质粒。

6.一种唾液酸酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

制备唾液酸酶基因片段；

将所述唾液酸酶基因片段克隆到pMD-18T中，得到连接产物，将所述连接产物转化E.coliJM109，挑选阳性克隆子测序，获得如SEQ ID NO：1所示的基因序列；

将所述阳性克隆子和原核表达载体连接，得到所述唾液酸酶基因重组表达载体；

将所述唾液酸酶基因重组表达载体进行转化，得到重组工程菌；

对得到的所述重组工程菌进行发酵诱导表达、纯化，得到所述唾液酸酶。

7.如权利要求6所述的唾液酸酶的制备方法，其特征在于，对得到的重组工程菌进行发酵诱导表达、纯化的步骤中，发酵诱导表达的方法如下：

得到的重组工程菌接种到含氨苄青霉素LB液体培养基，于37℃，180rpm过夜培养，然后，将过夜培养的菌液全部移到新鲜LB液体培养基中，接着于37℃，180rpm培养3-4h直到OD₆₀₀＝0.8-1.0，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，转移到30℃，180rpm诱导4h后，离心收集菌体。

8.如权利要求7所述的唾液酸酶的制备方法，其特征在于，对得到的含有所述唾液酸酶基因重组表达载体的工程菌进行发酵诱导表达、纯化的步骤中，纯化的步骤如下：

将离心收集的菌体用1xPBS冲洗两次，离心收集菌体后用10mL含10mmol咪唑的裂解缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清液，接着将所述上清液移到镍柱中充分混合静置使其自然下沉，然后用40mL含60mmol-80mmol咪唑的洗涤缓冲液冲洗杂蛋白，接着，用4mL含350mmol-500mmol咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，并用干净的离心管收集目的蛋白，得到所述唾液酸酶。

9.一种采用如权利要求1-5中任意一项所述的唾液酸酶基因重组表达载体的构建方法制得的唾液酸酶基因重组表达载体。

10.一种采用如权利要求6-8中任意一项所述的唾液酸酶的制备方法制备得到的唾液酸酶。