[发明专利]唾液酸酶基因重组表达载体及其构建方法，唾液酸酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及表达载体构建方法技术领域，尤其涉及一种唾液酸酶基因重组表达载体及其构建方法，唾液酸酶及其制备方法。

背景技术

唾液酸是一类含9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖,广泛存在于动物组织及微生物中，是细胞膜糖蛋白和糖脂的重要组成部分。唾液酸一般不以游离态的形式存在,它通常与细胞表面的糖蛋白和糖脂等生物大分子结合形成缀合物，并存在于缀合物的末端，在细胞的分化、成熟、细胞与生物大分子间相互作用等生理生化过程中起重要作用。在自然界中已发现五十余种结构不同的唾液酸，其中最为重要研究最多的唾液酸是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac),它是唾液酸家族中最主要的成员之一,含量占整个唾液酸家族的99％以上，通常是唾液酸家族其他成员生物合成的前体，具有多样的生物学功能。唾液酸在糖和蛋白相互作用有关的生理过程中起着很重要的作用，例如：细胞的粘附、信号传递、糖蛋白的稳定性、细菌致病性、病毒侵染、炎症和肿瘤的转移等。由于N-乙酰神经氨酸的含量占整个唾液酸家族的99％以上，因此人们对它的研究也较为深入，而对N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的生产一般有以下几种方法获得：从天然材料提取、化学合成、酶法合成以及微生物发酵等方法。酶法合成N-乙酰神经氨酸起始于唾液酸酶或N-乙酰神经氨酸醛缩酶的发现和应用。N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NAL，EC4.1.3.3)又称为N-乙酰神经氨酸裂合酶(Neu5Ac lyase)，它是唾液酸代谢的终端酶，既能催化唾液酸(Neu5Ac)裂解形成丙酮酸(Pyruvate)和N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)，在一定条件下也能缩合N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸(Pyruvate)生成N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，已有报道利用该酶合成唾液酸和它的类似物。唾液酸酶在动物组织及一些微生物中都有存在，动物体内,该酶主要作用是控制唾液酸的循环，微生物体内,除起到调控作用外，它不仅能把游离的唾液酸降解成可利用的碳源和氮源,还能催化唾液酸的合成。至今为止，对深海无脊椎动物共生微生物来源的唾液酸酶研究尚未见到报道，由于深海特殊的生态环境(低温、高压和寡营养等)及采样技术与工具的欠缺，捕获生物相对困难，促使对深海无脊椎动物共生微生物来源的唾液酸酶的研究报道非常有限，因此人们对该来源的唾液酸酶了解知之甚少。

发明内容

鉴于此，有必要提供一种唾液酸酶基因重组表达载体及其构建方法，唾液酸酶及其制备方法。

一种唾液酸酶基因重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：

制备唾液酸酶基因片段；

将所述唾液酸酶基因片段克隆到pMD-18T中，得到连接产物，将所述连接产物转化E.coliJM109，挑选阳性克隆子测序，获得如SEQ ID NO：1所示的基因序列；

将所述阳性克隆子和原核表达载体连接，得到所述唾液酸酶基因重组表达载体。

在其中一个实施例中，制备唾液酸酶基因片段的方法如下：

采用PowerLyzer^RPowersoilDNAisolation kit提取大王具足虫肠胃微生物基因组DNA作为模板进行聚合酶链式反应，得到所述唾液酸酶基因片段；其中，聚合酶链式反应采用的引物如下：

引物F：5’-GGATCCATGGAAAAATTAACAGGAATTTTTG-3’；

引物R：5’-GTCGACTTATGAAAGATATTTATCAATTATGTT-3’。

在其中一个实施例中，将所述唾液酸酶基因片段克隆到pMD-18T中的步骤前，还包括如下步骤：

将所述唾液酸酶基因片段用琼脂糖凝胶电泳检测，检测后用胶回收试剂盒进行纯化回收。

在其中一个实施例中，将所述阳性克隆子和原核表达载体连接的方法如下：

将所述阳性克隆子和原核表达载体分别经BamHI和SalⅠ双酶切后，电泳回收酶切片段，并用T4连接酶在16℃连接2h，得到所述唾液酸酶基因重组表达载体。

在其中一个实施例中，所述原核表达载体为质粒。

一种唾液酸酶的制备方法，包括如下步骤：

制备唾液酸酶基因片段；

将所述唾液酸酶基因片段克隆到pMD-18T中，得到连接产物，将连接产物转化E.coliJM109，挑选阳性克隆子测序，获得如SEQ ID NO：1所示的基因序列；

将所述阳性克隆子和原核表达载体连接，得到所述唾液酸酶基因重组表达载体；

将所述唾液酸酶基因重组表达载体进行转化，得到重组工程菌；