[发明专利]嗜水气单胞菌表面特异性抗原AhsA及其抗体和应用

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质分离纯化技术领域。更具体地，涉及嗜水气单胞菌表面特异性抗原AhsA及其多克隆抗体和应用。

背景技术

嗜水气单胞菌是养殖及野生鱼类常见的致病菌之一，鱼类的嗜水气单胞菌病往往呈爆发性流行趋势，造成鱼类的大面积死亡而导致养殖渔业的严重经济损失，同时该菌也可通过生物链感染人体，造成人体的多种疾病。目前，鱼类嗜水气单胞菌病的诊断方法主要是根据发病的季节进行调查访问，并对患病鱼体进行解剖检查，诊断速度和诊断准确性都受到一定程度的限制。有条件的情况下可利用抗嗜水气单胞菌多克隆抗体为基础的免疫学检查；另一方面，鱼类嗜水气单胞菌病的治疗主要依靠各种抗生素，对环境、鱼体以及消费者均有不利影响。抗生素的长期使用造成的耐药菌株的出现，也对抗生素的使用构成挑战而鱼类嗜水气单胞菌病的预防方面也缺乏有效的疫苗。

现有的研究显示，嗜水气单胞菌中致病因子主要有气溶素(aerolysin)、溶血素(hemolysin)、细胞毒性肠毒素(cytolyticen-terotoxin)、胞外蛋白酶(extracellular protease)、载铁体、S层蛋白及Ⅳ型菌毛等。其中胞外蛋白酶是最重要的致病因子之一，而AhsA蛋白则是嗜水气单胞菌中典型的胞外蛋白酶。由于目前缺乏对该蛋白的高效表达纯化，无法对基于此蛋白制备的多克隆抗体进行相关研究。

发明内容

本发明旨在解决嗜水气单胞菌表面特异性抗原AhsA蛋白异源表达含量低，浓度差等技术问题，制备得到高纯度，高浓度嗜水气单胞菌表面特异性抗原AhsA，该蛋白特异性地表达于嗜水气单胞菌表面，利用该蛋白制备出相应的多克隆抗体，可成功检测嗜水气单胞菌，进而为该菌的临床诊断及预防提供理论支持。

本发明的技术方案如下：嗜水气单胞菌表面特异性抗原AhsA，由基因片段在大肠杆菌细胞中表达，并经过纯化制备得到；所述的基因片段序列如下：

TCAGCTGCCGCTCTGGGGGTCGTCGATCACCAGCTTGCCATCCTTGACCGGGATGGTGGCGCCGGGGGCC

TTGTTCATGCGGATCACCCCTTCCTGACCGGCGAGGCGGTAGGTGACGTCATAGCCAAGGGTGCGGGTGC

TGCTCTCTTGCACCGTCTTGCAGCGCTGTTCGGTGGTGGTGTAGGTATCACCGGCCTGCATGTTGCCCTG

CACCTGGTTGCCGGCATAGCCACCCGCCACGGCGCCTGCGGCGGTCGCCACCTTCTTGCCGTTGCCGCCA

CCAAACTGGTTGCCGAGCACCCCGCCCAGCGCCGCACCGACCACGGTACCCAGGATCTTGTGCTCGTCCT

GCACCGGTTTGCGGTGGGTCACGCTGACGTTGCGACACTCCTGACGGGGGGTCTTGATGGTCTCGGTCAC

CGCTTTGCTGGCCAGCACTTCGGCGAACTGAGGCTGTGATGAAAACAGGGATCCGCTGGCGGCGGCTGAC

AAGGCCAGCGCAGAGGCCACACCGATCCCGACTCCTGCCAACATGGATTTGTTCAT。

该基因序列收录于Gene Bank中，基因号为：ABK39242.1；在大连宝生物公司合成其基因。

进一步的，经纯化制备的抗原AhsA浓度为10mg/L。

进一步的，制备方法为：将所述的基因片段的编码区克隆进pET-28a载体，转化大肠杆菌BL21感受态细菌；待感受态细菌生长至对数生长期前期，以0.5mM IPTG诱导表达AhsA蛋白，25℃诱导24小时后离心收集菌体；

将收集的菌体以20mM Tris-HCl,150mM NaCl重悬，超声裂解，离心取裂解液上清液，将上清液通过镍柱纯化，以咪唑溶液洗脱，再进行凝胶过滤纯化。

本发明同时请求保护利用所述的嗜水气单胞菌表面特异性抗原AhsA制备的抗体，制备方法如下：

S1.原核表达和纯化表面特异性抗原AhsA；

S2.免疫四次家兔，间隔分别为一周、两周、三周，获得含嗜水气单胞菌多克隆抗体的血清；

S3.利用间接Elisa效价检测纯化血清，获得纯化的基于嗜水气单胞菌表面特异性抗原AhsA的多克隆抗体。

本发明同时请求保护所述的嗜水气单胞菌表面特异性抗原AhsA制备的抗体在特异性的识别嗜水气单胞菌方面的应用。