[发明专利]一种重组酿酒酵母及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种重组酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。本发明所述重组酿酒酵母实现了以酪氨酸为底物生产8‑二甲基异戊烯基柚皮素，在重组酿酒酵母菌株中，圆红冬孢酵母来源TAL基因、欧芹来源TAL基因、拟南芥来源CHS基因、蜜柑来源CHI基因和苦参来源N8DT基因组合具有高产8‑二甲基异戊烯基柚皮素的效果，实验表明8‑二甲基异戊烯基柚皮素产量可达36.7μg/L。利用本发明所述重组酿酒酵母菌株生产8‑二甲基异戊烯基柚皮素相对于植物提取和化学合成成本低、副产物少且污染小，为8二甲基异戊烯基柚皮素及其相关产物的生产提供了一种切实可行的方法，并为淫羊藿素、淫羊藿苷的生物合成打下基础。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。

背景技术

黄酮类药物作为一种具有药用价值的天然化合物，因为其具有抗菌、抗炎、抗癌、解痉和利胆作用等方面的作用被广泛应用。8-二甲基异戊烯基柚皮素(8DN)作为生产黄酮类类药物淫羊藿苷的重要中间体，在医药合成领域有重大应用。目前，8DN的制备大多采用植物提取和化学合成的方法实现，但植物提取过程步骤多、收率低、副产物分离复杂，而化学合成则容易对环境造成污染，极大的限制了8DN的生产和应用。相较而言微生物合成以低成本、高产量和产品安全性等被认为是有前途的生产方法。

酿酒酵母作为公认的安全模式微生物，遗传背景清楚、基因操作简单、可进行大规模发酵生产。8DN在酵母细胞中的合成，需要先进行生产柚皮素路径的构建，同时引入外源基因N8DT进而获得目标产物，在酿酒酵母中通过饲喂柚皮素的生物转化方法得到的8DN。已有的相关文献是Sasaki等人在2007年发现了苦参体内存在将柚皮素转化为8-二甲基丙烯基柚皮素的关键酶N8DT，2009年日本京都大学植物基因表达实验室的Yazaki课题组通过外源添加柚皮素，同时引入苦参来源的N8DT基因获得8二甲基异戊烯基柚皮素，产量为20μg/g。但该生产方式受限于原料柚皮素的高成本和柚皮素难以进入酵母细胞的低利用率。目前，还未发现在酿酒酵母中从初级氨基酸出发直接得到8DN的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种在酿酒酵母中从酪氨酸出发直接得到8-二甲基丙烯基柚皮素的重组酿酒酵母菌株及其构建方法与应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种重组酿酒酵母菌株，包含经优化的TAL基因、4CL基因、CHS基因、CHI基因和N8DT基因，所述TAL基因为圆红冬孢酵母来源TAL基因序列；所述4CL基因为欧芹来源TAL基因序列；所述CHS基因为拟南芥来源CHS基因序列；所述CHI基因为蜜柑来源CHI基因序列；所述N8DT基因为苦参来源N8DT基因序列。

优选的，所述经优化为经过酿酒酵母密码子优化并规避BsaⅠ限制性内切酶酶切位点，同时在基因两端分别添加SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。

优选的，所述TAL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述4CL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述CHS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述CHI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；所述N8DT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

本发明还提供了所述重组酿酒酵母菌株的构建方法，将经优化的TAL基因、4CL基因、CHS基因、CHI基因和N8DT基因整合到酿酒酵母底盘菌株基因组中。

其中，优选的，所述酿酒酵母底盘菌株为酿酒酵母CENpK2-1d。

进一步优选的，具体包含如下步骤：