[发明专利]STORM/PALM显微成像方法及装置

说明书

一种STORM/PALM显微成像方法及装置，其中方法包括以下步骤：将样品置于具有与样品匹配的折射率匹配液的样品池中；产生激发光和活化光；将所述激发光和活化光合并形成照明光；用所述照明光照射样品，通过成像物镜完成样品的成像，且所述成像物镜的前端置于所述折射率匹配液中。本发明将样品和成像透镜置于折射率匹配溶液中，可以有效控制样品深部的化学环境，为超高分辨成像提供了长时间稳定的光化学环境；另外以扫描光片方式照明厚样品，且以飞秒脉冲激光即行扫描双光子活化，减少了散射对照明、成像的影响，从而为厚样品的成像成为可能。

技术领域

本发明涉及一种光学成像方法及装置，尤其涉及一种适用于厚样品的STORM/PALM显微成像方法及装置。

背景技术

近年发明的STORM/PALM超高分辨率光学显微技术，突破了传统光学成像的衍射分辨率极限，分辨率达到20～30nm甚至更低。然而，这种技术的应用还有很多限制。其中最主要的一点是，这种技术的观测深度有较大限制，其深度一般不超过几微米，因而只能应用于成像薄样品或样品表面。

这一限制的原因首先在于，STORM/PALM的成像分辨率取决于单分子定位的精度，而为了高精度的单分子定位，必须高效的排除背景荧光以提高信噪比。为此，常规STORM的技术方案采取的是全内反射荧光(TIRF)或类似照明方式，这就造成了前述的观测深度限制。使用光片(LSM，或者SPIM)照明可以在厚样品内选择性的激发一个薄片区域，避免了大部背景的激发，可以有效的降低背景。Zanacchi等人提出了使用光片照明的方法，但是只实现了对一个细胞的组蛋白H2B的成像。未能对厚样品的成像提供解决方案。

但使用光片照明进行厚样品的STORM/PALM成像仍存在一些问题。其中一个问题是样品散射对光片实际形状有一定的影响，常用的生物医学样品内部折射率不均匀，吸收不大但散射强烈，从而使得光片在厚样品内迅速失去片状照明的特性，且被激发的荧光也难以清晰成像。常规分辨率下厚样品成像的经验告诉我们，使用短脉冲激光双光子成像可能在一定程度上改善照明的弥散情况。Zanacchi等人概念性的提出以双光子光片照明作为活化光的方法，但未能真正展示厚样品STORM/PALM成像的可行性，且仅照明这一方面的改善，不能解决散射样品中单分子成像的问题。厚样品的STORM/PALM成像的另一个问题是很难形成样品深部的化学微环境，这是因为STORM成像需要一系列缓冲剂用于改善成像区域荧光染料的激发特性，而这些缓冲剂很难作用到厚样品内部，从而造成这一方法在厚样品中应用的障碍。

发明内容

基于以上问题，本发明提出一种用于STORM/PALM显微成像方法及装置，用于解决上述技术问题中的至少之一。

为了实现上述目的，作为本发明的一个方面，本发明提出一种STORM/PALM显微成像方法，该方法包括以下步骤：

步骤S1、将样品置于具有与样品匹配的折射率匹配液的样品池中；

步骤S2、产生激发光和活化光；

步骤S3、将激发光和活化光合并形成照明光；

步骤S4、用照明光照射样品，通过成像物镜完成样品的成像，且成像物镜的前端置于折射率匹配液中。

进一步地，上述折射率匹配溶液包含有5％以上的葡萄糖；该折射率匹配溶液的折射率包括1.35～1.50。

进一步地，上述折射率匹配溶液还包含有添加剂，该添加剂包括三羟甲基氨基甲烷、碳酸二氢钙、磷酸氢钙和氯化钙中的至少一种。

进一步地，上述活化光为飞秒脉冲激光以扫描光片照明的方式提供的活化光。

进一步地，上述飞秒脉冲激光的波长范围为690nm～1080nm。

进一步地，在上述步骤S1之前，所述显微成像方法还包括对样品进行透明化处理。