[发明专利]一种蛋白A亲和层析介质的应用

说明书

技术领域

本发明涉及化学材料合成及生物医药下游技术等领域，具体涉及一种蛋白A亲和层析介质的应用。

背景技术

近年来，抗体药物发展迅速。2016年，全球销售额前10位的药物中有6个是抗体药物，且前5位均是。抗体药物的纯化通常采用经典的三步或两步层析法，而蛋白A亲和介质以蛋白A配基上多个区域对抗体Fc段独特的专一吸附能力，可用作抗体捕获步骤，一步工艺即可去除细胞发酵液中大部分的杂质，可达99％以上的纯度。随着抗体药物的发展，用作抗体捕获的亲和层析介质也取得了快速发展。

但蛋白A亲和层析介质较昂贵，可占抗体药物下游纯化工艺中层析介质成本的85％。因此，亲和层析介质的选择，不仅关系到产品的质量，还关系到产品的市场竞争力。蛋白A亲和层析介质在抗体纯化过程中会出现蛋白A配基脱落，这些工艺相关杂质若不能在后续工艺中很好地去除，则存在引起免疫反应的风险。早期的蛋白A亲和层析配基脱落严重，填料生产商致力于增加介质的化学耐受性，由此可降低填料的使用成本及提高制品的质量。因此，目前主流蛋白A亲和层析介质如GE的MabSelect SuRe，为耐碱性介质，可耐0.1-0.5N NaOH清洗。这些稳定性增强的蛋白A亲和层析介质的清洗和消毒，可采用金标准氢氧化钠溶液进行，从而高效、低成本地除去附着在填料上的蛋白沉淀物、疏水性蛋白、核酸、内毒素和病毒等。

目前，国内抗体生产大都采用进口蛋白A亲和层析介质。如GE的MabSelect SuRe，其基质为高交联的琼脂糖微球，优点是亲水性极佳，生物相容性好，非常适合抗体类生物大分子的分离纯化；但缺点是其结构偏软，粒径分布较宽，在实际使用过程中存在装柱重复性差，机械强度低等问题。Millipore公司的Prosep Ultra Plus也是一种使用较为广泛的蛋白A亲和层析介质，基质为孔道可控的玻璃珠结构，亲水性好，载量很高。但是，玻璃珠结构有一致命缺陷为其不可耐高浓度NaOH清洗这一金标准，因而限制其在大规模生物样品中应用。

本发明的蛋白A亲和层析介质用作抗体及Fc融合蛋白分离纯化介质，载量高，可大幅度提高流速，分离时间短，分离效果好，装柱重复性好，机械强度高，成本低廉，适合用于抗体类及Fc融合蛋白的快速分离纯化，特推出本发明。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种蛋白A亲和层析介质的应用，分离效率高、效果好、成本低、适合工业化大规模分离纯化抗体及Fc融合蛋白。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：一种蛋白A亲和层析介质的应用，所述蛋白A亲和层析介质作为层析介质应用于抗体及Fc融合蛋白的分离纯化中；所述蛋白A亲和层析介质以含乙烯基单体的聚合物微球为基质，经亲水性树枝状大分子修饰、活化、偶联蛋白A配基并封尾后得到。

其中，所述蛋白A亲和层析介质为多孔聚合物微球介质。

其中，所述亲水性树枝状大分子修饰为在所述聚合物微球表面功能团上接枝亲水性树枝状大分子，所述亲水性树枝状大分子包括但不限于超支化聚乙烯醇或聚甘油类大分子。

其中，所述活化为在所述聚合物微球表面接上功能团，所述功能团包括但不限于环氧、氨基、羧基类功能团。

活化可以指利用环氧氯丙烷、1，4-丁二醇二缩水甘油醚等偶联剂与亲水化修饰的微球表面的羟基等功能团反应，未反应一端包含环氧结构。

其中，所述偶联蛋白A配基，为将蛋白A配基偶联到所述聚合物微球活化后的表面功能团上。

偶联蛋白A(或蛋白A偶联)可以指利用蛋白A分子中的巯基与活化后微球表面的环氧基进行反应，并形成硫醚键的稳定结构。

其中，所述封尾可以指利用含有羟基、巯基或氨基类的小分子与偶联蛋白A配基后的聚合物微球表面的活性功能团进行反应，消除未反应的活性功能团。

其中，所述作为基质的含乙烯基单体的聚合物微球是粒径均一、有孔的单分散多孔微球。

其中，所述含乙烯基单体包含至少一种单乙烯基单体，或包含至少一种多乙烯基单体。

其中，所述含乙烯基单体的聚合物微球的直径范围为5～100μm；所述含乙烯基单体的聚合物微球的孔径范围为80～120nm。

其中，所述蛋白A亲和层析介质作为层析介质应用于抗体及Fc融合蛋白的分离纯化时，可以20mM PBS+150mM NaCl，pH7.0-pH8.0或50mM磷酸二氢钠+100mMNaAc+150mM NaCl，pH7.0-pH8.0等缓冲液作为平衡相，以50mM Gly，pH3.0-pH4.0等缓冲液作为洗脱相。