[发明专利]一种碱基编辑系统及其构建和应用方法

说明书

本发明提供了一种碱基编辑系统及其构建和应用方法。所述的碱基编辑系统，其特征在于，包括UGI表达载体和BE3表达载体，或包括UGI和BE3共表达载体。本发明在国际上首次通过增加CRISPR碱基编辑器产生的C‑T编辑率并降低CRISPR系统本身引起的碱基插入或缺失率，从而增强了CRISPR碱基编辑器的功效，为CRISPR碱基编辑器在各物种的基因组中实施更为准确和安全的碱基编辑提供了新的方法和思路。

技术领域

本发明涉及基因组编辑领域，具体涉及一种增强的CRISPR碱基编辑系统实现高效率和高精度的碱基水平基因组编辑方法及其应用。

背景技术

基因组编辑技术指利用可设计的核酸酶(分子剪刀)通过碱基插入、缺失或置换等方式，对生物体基因组DNA特定片段进行改造从而达到对目标基因进行编辑的一种基因工程技术。利用基因组编辑技术对细胞进行遗传学操纵，可广泛的应用于生命科学基础研究、生物技术开发、农业技术开发以及医药研发领域。例如：直接在体内校正引起遗传疾病的基因突变，将能够从根本上治疗遗传疾病；对农作物进行精确的基因工程改造，使其产量提高或能够抵抗环境污染或病原体的感染；对微生物基因组进行精准改造，从而促进可再生生物能源的开发等。

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)基因组编辑系统自问世以来，就有着其它基因组编辑技术无可比拟的优势，被认为能够在活细胞中广泛使用，并且是迄今为止最有效、最便捷的基因组编辑系统。Cas9核酸酶利用引导RNA(guide RNA，gRNA)可在多种细胞的基因组特定靶点定位，对其进行切割从而产生DNA双链断裂(double strand breaks，DSBs)，然后利用细胞内源的DNA修复机制来实现编辑。根据不同DNA修复通路的激活，基因组编辑将会导致基因的失活或者突变的校正。通常来说，有两种主要的修复机制会被DSB所激活，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，另一种是同源性介导修复(homology-directed repair，HDR)。做为DNA双链断裂最主要的修复通路，NHEJ在修复过程中能在DSB附近的基因组位点引入随机性碱基插入或缺失，从而导致基因的失活。与NHEJ相反，当HDR被激活时能够以外源性供体DNA作为模版，利用同源重组机制将外源性供体DNA的序列替换靶点基因组DNA的序列，从而完成基因突变的校正。但实际上，由于同源重组机制本身的局限性，HDR介导的基因校正效率一直很低(通常小于5％)。因此，极大限制了CRISPR/Cas基因组编辑工具从科研向应用的转化，尤其是在精准基因治疗方面的应用，这也是基因编辑领域的一大难题。

为了提高基因突变的校正效率，碱基编辑器(base editor，BE)在近期内应运而生。这种碱基编辑器将CRISPR/Cas系统和APOBEC胞嘧啶脱氨酶家族成员整合在一起，可执行将胞嘧啶(cytosine，C)编辑为胸腺嘧啶(thymine，T)的功能。为了最大程度地提升C-T碱基编辑的效率，研究人员尝试了将完全丧失酶活性的dCas9或者具有切刻酶活性的nCas9与APOBEC整合，从而产生了碱基编辑器2(BE2)和碱基编辑器3(BE3)。相对于含有dCas9的BE2，含有nCas9的BE3虽然在靶点序列有着更高的C-T编辑效率，但BE3在靶点序列由CRISPR系统本身所引起的碱基插入或缺失(insertion/deletion，indel)率却更高，反而降低了碱基编辑的功效(C-T碱基编辑率与碱基插入或缺失率的比值，C-T editing rate/indel rate)及精确度。

因此，创造具有更高编辑功效的增强型碱基编辑系统，有助于实现高精度的碱基编辑，能极大地扩充我们对于碱基编辑器的应用，特别是在医疗领域进行精准基因治疗方面。

发明内容