[发明专利]一种快速检测鸽子性别的引物及其试剂盒和应用以及检测方法

说明书

一种快速检测鸽子性别的引物及其试剂盒和应用以及检测方法，它涉及禽类或鸟类检测领域。本发明的检测引物如SEQ ID No.1至No.4所示。含有上述引物的试剂盒。检测方法包括：鸽子羽髓样本总DNA的提取，LAMP反应和电泳检测或荧光染料检测，确定鸽子性别的方法。本发明可以利用羽髓快速抽提DNA和常规血液抽提DNA，作为模板用于LAMP实验。本发明根据鸽子(CHD1W)基因序列设计了LAMP引物，并建立检测鸽子性别的技术及其应用方法的试剂盒，具有快速、灵敏、高度特异性和易推广实用的优点。在早期雏鸽中快速鉴定出雏鸽性别，使鸽子性别比例适当，利于鸽舍安宁，提高产蛋率，利于产业化饲养管理和繁殖育种。

技术领域

本发明涉及禽类或鸟类检测领域，具体涉及鸽子羽髓DNA的提取、鸽子性别鉴定的LAMP引物组、检测鸽子性别的试剂盒及检测方法。

背景技术

鸽子是一种单态性鸟，其雌雄个体外貌形态几乎没有差别，极难从外形上区分开。鸽子的雌雄鉴别是肉鸽生产、繁殖工作中最为关键的一环，如果性别比例不当，不但鸽舍难以安宁，而且产蛋率也受影响，不利于产业化饲养管理与繁殖育种，尤其在幼鸽期去公留母的蛋鸽产业中更为突出。因此，雌雄鉴别在养鸽业具有重要作用。目前，传统的方法如翻肛鉴别、腹腔镜检、粪便类固醇检测及核型分析，它们存在准确性低、操作复杂、成本高、对鸽子伤害较大等缺点，虽然采用PCR技术对CHD基因内含子在Z和W染色体的差异进行扩增鉴定可以克服这些缺点，但是所需仪器和技术专业性强，检测环境要求苛刻、检测周期长，所以其推广及应用的成本非常高。因此，急需一种成本低，检测准确性高，易于推广的技术。

现有的环介导的等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是根据目的基因的6个特异区域,设计4～6条特异性引物，内引物(FIP、BIP)、外引物(F3、B3)、环引物(LF、LB)，利用Bst DNA聚合酶在60～65℃等温条件下特异地扩增目的基因。LAMP扩增反应可在2小时之内完成，其扩增产物是和靶标反向重复的茎环结构以及多环的菜花样结构，反应过程中产生大量焦磷酸根离子，加入荧光染料钙黄绿素后，焦磷酸根离子与Mn²⁺结合，钙黄绿素与Mg²⁺结合形成绿色荧光，没有反应的样品则不能产生焦磷酸根离子，钙黄绿素与Mn²⁺结合呈棕黄色。也可以通过反应后体系内是否存在白色沉淀物、电泳结果是否具有梯状条带、加入SYBRGreenl是否变成绿色等不同方法进行检测，具有检测灵敏度高，检测方法简单快速、仪器要求不高等特点。LAMP技术现已被广泛应用于微生物检测及胚胎性别鉴定等领域，如，食品安全检测、流行性病毒检测、临床诊断、对病菌、寄生虫等的检测，但是利用该技术对鸟类特别是鸽子的性别进行鉴定还没有报道，因此，如何运用环介导恒温扩增技术检测生产实践中鸽子性别的技术具有重大意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种简便、快速、准确鉴定鸽子性别的试剂盒和LAMP检测方法。

本发明的一种快速检测鸽子性别的引物，所述的引物为LAMP引物，其序列为：

上游外引物FIP序列

CCAGTCTTTTCCTGTATGTAAAATTAAGAAGCCTTGATCTTTACCA；

上游内引物BIP序列

CTGATGAATTAGAAAGATGAAGTGTCAAAACAACTGAGGGGGT；

下游外引物F3序列CAGGTGAGAATTTTTCTGGTA；

下游外引物B3序列AGCAACTTTAATTCTCAATTGC。

本发明的试剂盒为含有上述引物的试剂盒。

本发明的试剂盒用于检测鸽子性别，以及鉴定含Z和W染色体的鸟类和禽类的雌雄性别。