[发明专利]产β-丙氨酸的重组菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了产β‑丙氨酸的重组菌及其构建方法与应用。本发明所公开的重组菌的构建方法，包括：敲除受体菌的fadR基因、fabF基因、fabH基因、iclR基因、sucA基因和向受体菌中导入aspC基因或基因簇、panD基因、alkL基因和gdh基因以及增强受体菌中fadL基因、fadD基因、sthA基因、atoSC基因簇和aceBA基因簇的表达；受体菌为含有fadR基因、fabF基因、fabH基因、iclR基因和sucA基因的细菌或真菌。实验证明，利用本发明的重组菌以脂肪酸为原料生产β‑丙氨酸的转化率为60.87％，表明，可以利用本发明的重组菌制备β‑丙氨酸。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，产β-丙氨酸的重组菌及其构建方法与应用。

背景技术

β-丙氨酸(英文名β-Alanine)又名β-氨基丙酸，是一种具有重要价值的非蛋白质氨基酸。β-丙氨酸作为生化原料，在医药、饲料和食品等领域具有广泛的应用前景。例如，β-丙氨酸可以用于合成泛酸(维生素B5)，是多种代谢所必需的辅酶A的组成部分。

目前β-丙氨酸的合成方法主要包括为化学合成法和生物转化法，具体如下：

1.化学合成法

(1)丙烯酸法：主要通过将丙烯酸(或丙烯酸酯、丙烯酸盐)与氨水在较高的温度和压力下发生氨化反应，得到β-丙氨酸。丙烯酸法的主要问题是副产物多，需要高温高压等条件。丙烯酸本身的腐蚀性很强，对设备的要求较高。

(2)丙烯腈法：包括直接氨化法和氨化水解法。直接氨化法采用烯腈与氨水在高温高压下一步反应合成β-丙氨酸；氨化水解法则是丙烯腈与氨在高温高压下反应生成氨基丙腈，然后在酸性或碱性条件下水解反应生成β-丙氨酸。该方法同样由于需要高温高压对设备要求较高，同时由于使用的丙烯腈为剧毒原料，需要较高的安全防护措施。该方法收率较低，由于水解过程中生成大量无机盐，产品纯度不高。

(3)β-氨基丙腈法：β-氨基丙腈在酸性或碱性条件下水解生成β-丙氨酸。氨基丙腈法的特点是反应产率高，缺点是β-氨基丙腈的价格较高，水解过程中生成大量无机盐。

2.生物转化法

生物转化法主要是通过酶法转化或利用表达相关酶的全细胞催化获得β-丙氨酸。主要采用如下两类酶的催化作用，将不同的底物转化为β-丙氨酸。

(1)丙烯酸加氨酶法：主要是利用藤黄八叠球菌表达的β-丙烯酸加氨酶将丙烯酸转化为β-丙氨酸，但原料丙烯酸为强腐蚀性和刺激性液体，对人员安全和设备的要求较高，目前未见有产业化应用的报道。

(2)L-天冬氨酸-α-脱羧酶法：利用L-天冬氨酸-α-脱羧酶将L-天冬氨酸转化为-丙氨酸，该方法的成本取决于L-天冬氨酸原料的成本。

综上所述，化学合成法生产β-丙氨酸普遍面临反应条件苛刻、不宜分离纯化、容易造成环境污染等问题。而生物转化法生产β-丙氨酸需要建立廉价的原料路线，才能降低生产成本，形成具有推广前景的生产模式。脂肪酸是一类具有高度还原状态的物质，用于生物转化的脂肪酸原料可以从油料粗加工产物、地沟油等来源以低廉的价格获取。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何生产β-丙氨酸。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了重组菌的构建方法。

本发明所提供的重组菌的构建方法，包括对受体菌进行甲或乙的改造，得到所述重组菌；所述甲为A1和A8；所述乙为A1和A8以及A2-A7这六种中的全部或部分；

A1、敲除所述受体菌的脂肪酸降解转录因子fadR基因或抑制除所述fadR基因的表达或抑制所述fadR基因编码的蛋白质的活性；

A2、敲除所述受体菌的β-酮脂酰-ACP合酶II基因fabF基因或抑制除所述fabF基因的表达或抑制所述fabF基因编码的蛋白质的活性；