[发明专利]对昆虫蛋白或昆虫表达系统表达的外源蛋白进行标记的方法

权利要求书

1.一种对昆虫细胞中糖蛋白进行原位标记的方法，所述方法包含如下步骤：

（i）在昆虫细胞培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖，将昆虫细胞接种入所述培养基中并对所述昆虫细胞进行培养，得到细胞悬液，其中，所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖为1,3,4,6-四-O-乙酰基-N-叠氮乙酰氨基葡萄糖；

（ii）收集步骤（i）得到的细胞悬液，离心，得到所述细胞的沉淀；

（iii）对步骤（ii）获得的所述沉淀中的细胞进行固定；

（iv）向步骤（iii）的经固定的细胞中添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述可检测标记物偶联至所述细胞内的糖蛋白；

（v）对所述可检测标记物进行检测。

2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤（iv）中，所述连接有炔基的可检测标记物选自于由如下物质所组成的组：

式（II-1），

式（II-2），

式（II-3），

式（II-4），和

式（II-5）；

其中，所述连接有三芳基膦的可检测标记物选自于由如下物质所组成的组：

式（II-6）

其中，所述是直接或间接连接至炔基部分或三芳基膦部分的可检测标记物。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，步骤（iv）中，所述可检测标记物选自于由如下物质所组成的组：放射性同位素、发色团、抗体、化学发光化合物、光谱比色标记物、荧光化合物、金属螯合物和酶。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述放射性同位素选自于由如下物质所组成的组：

³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、³²P和³³P。

5.如权利要求3所述的方法，其中，所述荧光化合物选自于由如下物质所组成的组：

荧光素、罗丹明或罗丹明衍生物、青色素染料、香豆素。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述荧光素选自6-羧基荧光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素、异硫氰酸荧光素。

7.如权利要求5所述的方法，其中，所述罗丹明衍生物选自N,N,N’,N’-四甲基-6羧基罗丹明、6-羧基-X-罗丹明、5-羧基罗丹明-6G、6-羧基罗丹明-6G、罗丹明110、四罗丹明异硫氰酸酯。

8.如权利要求5所述的方法，其中，所述青色素染料选自Cy3、Cy5和Cy7染料。

9.如权利要求5所述的方法，其中，所述香豆素为伞形酮。

10.如权利要求3所述的方法，其中，所述酶选自于萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶。

11.如权利要求3所述的方法，其中，所述酶选自于由如下物质所组成的组：

苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异源性酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。

12.如权利要求3所述的方法，其中，所述化学发光化合物选自于由如下物质所组成的组：

光泽精、鲁米诺、（金刚烷）-1,2-二氧乙烷、异鲁米诺、咪唑、吖啶酯、吖啶酰胺、三联吡啶钌和草酸酯。

13.如权利要求3所述的方法，其中，所述光谱比色标记物选自于由如下物质所组成的组：

胶体金或者有色玻璃或塑料珠。