[发明专利]对昆虫蛋白或昆虫表达系统表达的外源蛋白进行标记的方法

说明书

本发明涉及一种对昆虫来源的蛋白进行标记的方法。所述方法借助昆虫自身代谢通路将叠氮修饰的全乙酰化N‑乙酰氨基葡萄糖掺入至昆虫表达的蛋白的糖基，随后通过点击化学反应，将可检测标记物偶联至蛋白，从而实现对昆虫来源的蛋白的标记。所述方法可用于原位标记昆虫细胞或标记昆虫表达系统所表达的外源蛋白。

技术领域

本发明涉及通过生物正交反应对昆虫来源的蛋白进行标记的方法。该方法可实现昆虫细胞中的蛋白的原位标记，也可实现对昆虫杆状病毒表达系统所表达的外源蛋白进行标记。

背景技术

蛋白是细胞内最丰富的生物大分子，它几乎参与所有的生命过程。因此，对蛋白的结构、功能和相互作用的研究是生命科学领域的一项重要任务。在很多情况下，需要对蛋白进行标记来实现实时和/或定量的观测。目前最常用的标记蛋白的方法包括荧光蛋白(fluorescent protein)、放射性同位素以及通过化学反应将荧光基团非特异性地修饰至蛋白中的赖氨酸或酪氨酸。然而，这些方法往往操作复杂，还可能对蛋白的结构、功能和定位产生影响。针对传统方法的上述缺陷，近十几年来发展的生物正交反应为蛋白的标记或修饰提供了新的可能。

生物正交反应是指具有如下特征的化学反应：在生理条件下进行，不干扰同时发生的其它生化反应或各种生物内源过程，且不会对生物体及生物内源分子造成损伤。就借助生物正交反应实现蛋白标记而言，首先将生物正交反应基团引入蛋白，借助该正交反应基团与带有互补反应基团的标记物进行反应，将不同的标记物(例如荧光或免疫印迹标记物)偶联至蛋白，从而实现蛋白定位和功能的检测。目前最常用的生物正交反应基团对包括能够发生点击化学(Click Chemistry)反应的叠氮基-炔基以及叠氮基-三芳基膦。其中，叠氮基与三芳基膦发生的施陶丁格反应(Staudinger Ligation)或与炔基发生的环加成反应均能将与该生物正交反应基团对中的一个成员相连的蛋白偶联至与该生物正交反应基团对中的另一成员相连的可检测标记物，实现将可检测标记物修饰至蛋白的目的。其中，叠氮基团与高张力炔烃的环加成反应(Strain-promoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC)因其不需要添加催化剂而成为研究和应用热点。

最近发展了借助生物糖代谢途径将化学探针引入蛋白的策略。其以化学生物学方法为切入点，通过对非天然糖进行设计，在蛋白的糖链中引入生物正交反应基团，并借助生理条件下的生物正交反应引入探针分子。该方法能够在分子水平上揭示糖蛋白的定位与功能。然而，这种方法多用于哺乳动物细胞蛋白的标记。目前还未有利用非天然糖的生物正交反应对昆虫细胞或昆虫表达系统表达的蛋白进行标记的报道。

昆虫杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector Systems，BEVS)是目前应用广泛的蛋白表达体系，具有效率高、周期短、成本低等优点。此外，宿主昆虫细胞能够以多种复杂方式对合成的蛋白进行翻译后修饰，表达的重组蛋白在细胞内被折叠、修饰、运输、组装成最终的功能蛋白。其中，蛋白N-糖基化修饰是昆虫杆状病毒表达系统的重要特征，这对很多蛋白的正确折叠和发挥生物功能具有重要意义。然而，目前对昆虫蛋白进行标记的方法极少。最近报道了通过对宿主细胞进行遗传工程操作，使得宿主细胞能够表达将带有生物正交基团的非天然氨基酸插入肽链的氨酰tRNA合成酶；进而对目的蛋白的编码序列进行改造，将特定位点的核苷酸序列突变为琥珀终止子(UAG)，从而将该非天然氨基酸插入到目标蛋白的该特定位点，由此实现利用该非天然氨基酸对目标蛋白进行标记。然而，该方法操作复杂，实施周期长，不利于推广。

因此，仍存在对用于昆虫细胞和昆虫杆状病毒表达系统表达的蛋白进行标记的简捷方法的需求。

发明内容

针对本领域的上述问题，一方面，本发明提供了一种对昆虫细胞中的糖蛋白进行原位标记的方法，所述方法包含如下步骤：

(i)在昆虫细胞培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖，将昆虫细胞接种入所述培养基中并对所述昆虫细胞进行培养，得到细胞悬液；