[发明专利]一种大片段基因整合提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法

权利要求书

1.一种大片段基因整合提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）合成两端含有限制性内切酶酶切位点序列的如下DNA片段：

DNA片段1：酶切位点序列1-黑曲霉基因同源片段前段1-潮霉素抗性基因单元盒-里氏木霉基因组片段1-黑曲霉基因同源片段后段1-酶切位点序列2；

DNA片段1-2：酶切位点序列1-黑曲霉基因同源片段前段1-里氏木霉基因组片段1-酶切位点序列2；

DNA片段2：酶切位点序列1-黑曲霉基因同源片段前段2-潮霉素抗性基因单元盒-里氏木霉基因组片段2-黑曲霉基因同源片段后段2-酶切位点序列2；

其中，黑曲霉基因同源片段前段1的序列如SEQ ID NO.1所示，潮霉素抗性基因单元盒的序列如SEQ ID NO.2所示，里氏木霉基因组片段1的序列如SEQ ID NO.3所示，黑曲霉基因同源片段后段1的序列如SEQ ID NO.4所示，黑曲霉基因同源片段前段2的序列如SEQ ID NO.5所示，里氏木霉基因组片段2的序列如SEQ ID NO.6所示，黑曲霉基因同源片段后段2的序列如SEQ ID NO.7所示；

（2）将步骤（1）中的3个DNA片段分别连接到载体上构建得到同源重组载体1、同源重组载体1-2、同源重组载体2；

（3）用同源重组载体1转化黑曲霉，筛选得到同源重组成功的黑曲霉菌株1；

用同源重组载体1-2转化黑曲霉菌株1，筛选得到同源重组成功的黑曲霉菌株1-2；

用同源重组载体2转化黑曲霉菌株1-2，筛选得到同源重组成功的黑曲霉菌株2；

（4）将黑曲霉菌株2的基因组断裂片段导入到里氏木霉，以潮霉素抗性作为筛选标记，筛选得到同源重组成功的里氏木霉菌株G，里氏木霉菌株G的纤维素酶酶活得到提高。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的载体为pCAMBIA1300，酶切位点序列1、酶切位点序列2分别为SacII、HindIII的酶切位点序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的黑曲霉为黑曲霉CBS 513.88；所述的里氏木霉为里氏木霉QM6a。

4.一种纤维素酶酶活提高的里氏木霉菌株，其特征在：通过权利要求1-3任一项所述的方法得到。