[发明专利]一种大片段基因整合提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种大片段基因整合提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法。

背景技术

里氏木霉纤维素酶是一种广泛应用的酶类；里氏木霉具有很好的胞外酶表达能力，是食品或工业生产中广泛应用的菌种。里氏木霉产生的纤维素酶酶系组成中，葡糖苷酶的活力相对较低。已有的提高里氏木霉纤维素酶酶系的方法是通过基因工程的手段导入葡糖苷酶基因，提高葡糖苷酶的酶活；或者敲除某一些外分泌蛋白，降低外分泌蛋白的分泌量，从而提高纤维素酶蛋白的分泌量。目前这些方法中，每次只能剔除一个基因或增强一个基因的表达。

实际上，非纤维素酶的酶类对里氏木霉的代谢网络也会产生影响。非纤维素酶类和纤维素酶类的多克隆可能是提高纤维素酶酶活的一个创新型的策略。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大片段基因整合提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，该方法通过多次同源重组将黑曲霉维素酶系相关的基因大片段一次性整合到里氏木霉基因组中，达到纤维素酶基因、非纤维素酶基因多克隆的效果，从而影响里氏木霉的代谢网络，提高里氏木霉的纤维素酶酶活。本发明的目的还在于提供一种纤维素酶酶活提高的里氏木霉菌株。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种大片段基因整合提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，包括如下步骤：

（1）合成两端含有限制性内切酶酶切位点序列的如下DNA片段：

DNA片段1：酶切位点序列1-黑曲霉基因同源片段前段1-潮霉素抗性基因单元盒-里氏木霉基因组片段1-黑曲霉基因同源片段后段1-酶切位点序列2；

DNA片段1-2：酶切位点序列1-黑曲霉基因同源片段前段1-里氏木霉基因组片段1-酶切位点序列2；

DNA片段2：酶切位点序列1-黑曲霉基因同源片段前段2-潮霉素抗性基因单元盒-里氏木霉基因组片段2-黑曲霉基因同源片段后段2-酶切位点序列2。

其中，黑曲霉基因同源片段前段1的序列如SEQ ID NO.1所示，潮霉素抗性基因单元盒的序列如SEQ ID NO.2所示，里氏木霉基因组片段1的序列如SEQ ID NO.3所示，黑曲霉基因同源片段后段1的序列如SEQ ID NO.4所示，黑曲霉基因同源片段前段2的序列如SEQ ID NO.5所示，里氏木霉基因组片段2的序列如SEQ ID NO.6所示，黑曲霉基因同源片段后段2的序列如SEQ ID NO.7所示。

（2）将步骤（1）中的3个DNA片段分别连接到载体上构建得到同源重组载体1、同源重组载体1-2、同源重组载体2。

（3）用同源重组载体1转化黑曲霉，筛选得到同源重组成功的黑曲霉菌株1。黑曲霉菌株1的基因组上含有外源片段潮霉素抗性基因单元盒、里氏木霉基因组片段1。

用同源重组载体1-2转化黑曲霉菌株1，筛选得到同源重组成功的黑曲霉菌株1-2。黑曲霉菌株1-2在黑曲霉菌株1的基础上去除了潮霉素抗性基因单元盒，其基因组上含有外源片段里氏木霉基因组片段1。

用同源重组载体2转化黑曲霉菌株1-2，筛选得到同源重组成功的黑曲霉菌株2。黑曲霉菌株2的基因组上含有外源片段里氏木霉基因组片段1、潮霉素抗性基因单元盒、里氏木霉基因组片段2。

（4）将黑曲霉菌株2的基因组断裂片段导入到里氏木霉，以潮霉素抗性作为筛选标记，筛选得到同源重组成功的里氏木霉菌株G，里氏木霉菌株G的纤维素酶酶活得到提高。此过程的同源重组是以里氏木霉基因组片段1、里氏木霉基因组片段2为同源重组位点，将黑曲霉菌株2基因组上这两个位点之间的大片段整合到了里氏木霉基因组上。

优选的，上述方法中，所述的载体为pCAMBIA1300，酶切位点序列1、酶切位点序列2分别为SacII、HindIII的酶切位点序列；所述的黑曲霉为黑曲霉CBS 513.88；所述的里氏木霉为里氏木霉QM6a。

一种纤维素酶酶活提高的里氏木霉菌株，通过上述方法得到。

本发明大大提高了里氏木霉的纤维素酶酶活，所得到菌株的滤纸酶活是出发菌株的2.28倍。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1、材料

黑曲霉CBS 513.88，里氏木霉QM6a，质粒pCAMBIA1300（Biovector），农杆菌EHA105，大肠杆菌DH5α，限制性内切酶（TakaRA）等。