[发明专利]一种原代鸭肝细胞的分离及培养方法在审
| 申请号： | 201710255944.7 | 申请日： | 2017-04-19 |
| 公开（公告）号： | CN108728398A | 公开（公告）日： | 2018-11-02 |
| 发明（设计）人： | 不公告发明人 | 申请（专利权）人： | 江苏齐氏生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/071 | 分类号： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 214434 江苏省无锡市江阴市东*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 鸭肝细胞 恒流泵 预热的 灌注 缓冲液 细胞 混合酶溶液 完全培养基 戊巴比妥钠 腹腔注射 混合酶液 静脉插管 染色检测 筛网过滤 无菌条件 细胞活性 细胞滤液 细胞形态 培养瓶 振荡 包被 腹面 腹腔 肝素 剪碎 重悬 锥虫 切开 成活率 接种 麻醉 消化 检测 | ||
1.一种原代鸭肝细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选取1~2月的雄性重庆麻鸭，腹腔注射戊巴比妥钠和肝素；(2)将麻鸭麻醉后腹面向上固定于板上，无菌条件下切开腹腔；(3)静脉插管，用恒流泵灌注预热的HBSS缓冲液；(4)用恒流泵灌注预热的GBSS缓冲液；(5)用恒流泵灌注预热的GBSS混合酶溶液；(6)剪碎组织用GBSS混合酶液振荡消化，筛网过滤，离心，弃上清；(7)取细胞滤液用锥虫蓝染色检测细胞活性；(8)细胞计数后用完全培养基重悬接种到包被后的培养瓶，置于37℃、5% CO2环境中培养；(9)细胞形态鉴定；(10)ELISA法检测；(11)RT-PCR检测。
2.根据权利要求1所述的鸭肝细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(1)所用戊巴比妥钠浓度为30 mg/kg体重，肝素100 U/kg体重。
3.据权利要求1所述的鸭肝细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(3)所用HBSS缓冲液含1%~5%的BSA，PH为7.2~7.4。
4.根据权利要求1所述的鸭肝细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(3)和(4)所用恒流泵的灌注速度为5~15 ml/min，灌注时间5~20 min，灌注量40~60 ml。
5.根据权利要求1所述的鸭肝细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(5)和(6)所用GBSS混合酶液(PH为7.2~7.4)含0.1%~0.5% Ⅳ型胶原酶和0.002%~0.006% DNaseⅠ。
6.根据权利要求1所述的鸭肝细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(5)所用恒流泵的灌注速度为20~40 ml/min，灌注时间10~30 min，灌注量40~60 ml。
7.根据权利要求1所述的鸭肝细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(6)所述振荡消化时间10~30 min，80~200目筛网过滤。
8.根据权利要求1所述的鸭肝细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(8)所述的完全培养基为含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 u/ml链霉素的双抗、4~6 μg/ml胰岛素的H-DMEM培养基，pH为7.4。
9.根据权利要求1所述的鸭肝细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(8)所述的培养瓶用3~4 μg/cm2的多聚赖氨酸包被，培养条件为37℃、5%CO2培养箱。
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