[发明专利]一种原代鸭肝细胞的分离及培养方法

说明书

本发明提供了一种原代鸭肝细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：(1)选取1~2月的雄性重庆麻鸭，腹腔注射戊巴比妥钠和肝素；(2)将麻鸭麻醉后腹面向上固定于板上，无菌条件下切开腹腔；(3)静脉插管，用恒流泵灌注预热的HBSS缓冲液；(4)用恒流泵灌注预热的GBSS缓冲液；(5)用恒流泵灌注预热的GBSS混合酶溶液；(6)剪碎组织用GBSS混合酶液振荡消化，筛网过滤，离心，弃上清；(7)取细胞滤液用锥虫蓝染色检测细胞活性；(8)细胞计数后用完全培养基重悬接种到包被后的培养瓶，置于37℃、5% CO₂环境中培养；(9)细胞形态鉴定；(10)ELISA法检测；(11)RT‑PCR检测。本发明提供的一种鸭肝细胞的分离及培养方法，操作简单，所得细胞数量多，成活率高，是一种理想的原代鸭肝细胞分离与培养方法，为实验提供可靠的细胞资源。

技术领域

本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域，具体涉及一种原代鸭肝细胞的分离及培养方法。

背景技术

鸭乙型肝炎病毒(DHBV)和人乙型肝炎病毒(HBV)同属嗜肝DNA病毒科。由于DHBV和HBV十分相似，在HBV致病机理及其治疗研究过程中，DHBV感染鸭模型在动物实验模型中得到广泛应用。DHBV感染可以作为HBV感染人所致肝病的发病机制、筛选治疗人病毒性肝炎药物等的实验动物模型。研究DHBV感染可以间接认识HBV，本发明建立的原代鸭肝细胞的培养方法是研究HBV的一个重要工具，为筛选抗病毒药物提供了良好的体外培养条件。

目前肝细胞的分离方法有机械分离法、螯合法和酶消化法等。机械法操作简单，但分离获得的肝细胞数量少、活性差。Howard创建了胶原酶灌流法，Seglen进一步将这种方法发展为两步灌流法。胶原酶灌流法 得到的肝细胞数量和活性都得到提高，灌流法广泛应用于大鼠、小鼠、犬和兔等动物。

本发明在传统灌流法的基础上采用三步灌流法，旨在提供一种操作简单、高效的获得生长状态好、纯度高的原代鸭肝细胞的方法，建立一套完善可靠的原代鸭肝细胞体外培养技术。

发明内容

根据上述问题，本发明提供了一种鸭原代肝细胞的分离及培养方法，该方法操作简单，细胞产量和成活率高，是一种较为理想的原代鸭肝细胞培养方法，可以满足多种生理生化实验的要求。

一种原代鸭肝细胞的分离及培养方法步骤包括：(1)选取1~2月的雄性重庆麻鸭，腹腔注射戊巴比妥钠和肝素；(2)将麻鸭麻醉后腹面向上固定于板上，无菌条件下切开腹腔；(3)静脉插管，用恒流泵灌注预热的HBSS缓冲液；(4)用恒流泵灌注预热的GBSS缓冲液；(5)用恒流泵灌注预热的GBSS混合酶溶液；(6)剪碎组织用GBSS混合酶液振荡消化，筛网过滤，离心，弃上清；(7)取细胞滤液用锥虫蓝染色检测细胞活性；(8)细胞计数后用完全培养基重悬接种到包被后的培养瓶，置于37℃、5% CO₂环境中培养；(9)细胞形态鉴定；(10)ELISA法检测；(11)RT-PCR检测。

其中，步骤 (1) 所述的戊巴比妥钠浓度为30 mg/kg体重，肝素100 U/kg体重。

其中，步骤(3)所用的HBSS缓冲液(PH为7.2~7.4)含1%~5%的BSA以保持细胞的活性，防止酶的分解和非特异性吸附。

其中，步骤(3)和(4)所用的所用恒流泵灌注速度为5~15 ml/min，灌注时间5~20min，灌注量40~60 ml。

其中，步骤(5)和(6)所用GBSS混合酶液(PH为7.2~7.4)为含0.1%~0.5%Ⅳ型胶原酶和0.002%~0.006% DNaseⅠ的溶液。

其中，步骤(5)所用恒流泵灌注速度为20~40 ml/min，灌注时间10~30 min，灌注量40~60 ml。

其中，步骤(6)所述振荡消化时间10~30 min，80~200目筛网过滤。