[发明专利]用于定量检测黄化曲叶病毒的特异引物及其应用在审
| 申请号： | 201710256617.3 | 申请日： | 2017-04-19 |
| 公开（公告）号： | CN107058626A | 公开（公告）日： | 2017-08-18 |
| 发明（设计）人： | 李云龙;何晓青;王晓青;金一;王胤;孔维文;孙海;刘婷婷;胡彬;郑建秋;刘正雄;李清波;雷喜红;陈娟;王俊侠;张保常;张宁;孙艳艳;杨武群;张超;孙璐;张宝杰;李冬冬;周长青;吴继宗;蔡乐;饶玉燕 | 申请（专利权）人： | 北京市植物保护站 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京众合诚成知识产权代理有限公司11246 | 代理人： | 文芳 |
| 地址： | 100029 *** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 用于 定量 检测 黄化 病毒 特异 引物 及其 应用 | ||
1.一种用于定量检测黄化曲叶病毒的引物对，其特征在于，所述引物对含有序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列：
SEQ ID No.1：CCGTGACTATGTCGAAGCGA
SEQ ID No.2：GCTGTATGGGCTGTCGAAGT。
2.权利要求1所述的用于定量检测黄化曲叶病毒的引物对在定量检测黄化曲叶病毒中的应用。
3.权利要求1所述的用于定量检测黄化曲叶病毒的引物对在制备用于定量检测黄化曲叶病毒的试剂盒中的应用。
4.一种用于定量检测黄化曲叶病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的用于定量检测黄化曲叶病毒的引物对。
5.一种定量检测黄化曲叶病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：
对待测样品进行PMA处理，然后进行提取DNA的操作，再以提取的DNA为模板，用权利要求1所述的用于定量检测黄化曲叶病毒的引物对进行PMA-qPCR扩增；以及，
直接对待测样品进行提取DNA的操作，再以待测样品的DNA为模板，用权利要求1所述的用于定量检测黄化曲叶病毒的引物对进行qPCR扩增；
根据上述的qPCR扩增和PMA-qPCR扩增的结果，计算活的黄化曲叶病毒的含量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述根据qPCR扩增和PMA-qPCR扩增的结果，计算活的黄化曲叶病毒的含量的方法如下：
Y1＝-3.242*lg(X1)+36.4
Y2＝-3.242*lg(X2)+36.4
R＝X2/X1
其中，
“X1”为qPCR扩增测得的黄化曲叶病毒的起始拷贝数；“Y1”为qPCR扩增的Ct值；
“X2”为PMA-qPCR扩增测得的活的黄化曲叶病毒的起始拷贝数；“Y2”为PMA-qPCR扩增的Ct值；
“R”为活的黄化曲叶病毒占全部黄化曲叶病毒的比例。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述对待测样品进行PMA处理的操作包括：
将PMA工作液加入经过粉碎处理的待测样品中，使得PMA的终浓度达到5-20μg/mL，优选6-9μg/mL或8-12μg/mL或11-19μg/mL或12-18μg/mL或13-20μg/mL；然后光照处理3-8min，优选4-6min，进一步优选5min。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PMA工作液为用20％的DMSO配制成的1μg/μL的溶液。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述对待测样品进行PMA处理的操作在避光和低温的条件下进行，优选在避光和冰上进行。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述qPCR扩增和PMA-qPCR扩增的程序为：首先95℃10min，然后95℃1min、57℃30s、72℃1min的条件下进行四十个循环。
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