[发明专利]用于定量检测黄化曲叶病毒的特异引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于病原体检测领域，特别涉及一种用于定量检测黄化曲叶病毒的特异引物及其应用。

背景技术

传统的致病菌的检测方法，如生理生化指标鉴定方法，细菌的分离培养鉴定方法等都是依靠表型来鉴定致病菌；这些方法耗时长，灵敏度很低，而且准确度差。

叠氮溴化丙锭(PMA)是一种能与DNA高度亲和的荧光染料，它能穿过受损细胞膜，在可见光的照射下与DNA共价交联，从而达到阻碍受损细胞中的DNA进行PCR扩增的作用。有研究报道过PMA-qPCR方法结合检测活的病原体含量，但仅限应用于水体中(Fujimoto J,Watanabe K.Quantitative detection of viable bifidobacterium bifidum BF-1cells in human feces by using propidium monoazide and strain-specific primers[J].Applied and environmental microbiology,2013,79(7):2182-2188.；Van Frankenhuyzen J K,Trevors J T,Flemming C A,et al.Optimization,validation,and application of a real-time PCR protocol for quantification of viable bacterial cells in municipal sewage sludge and biosolids using reporter genes and Escherichia coli[J].Journal of industrial microbiology&biotechnology,2013,40(11):1251-1261.；Salam K W,El-Fadel M,Barbour E K,et al.A propidium monoazide–quantitative PCR method for the detection and quantification of viable Enterococcus faecalis in large-volume samples of marine waters[J].Applied microbiology and biotechnology,2014,98(20):8707-8718.；和Kim S,Ko G.Using propidium monoazide to distinguish between viable and nonviable bacteria,MS2and murine norovirus[J].Letters in applied microbiology,2012,55(3):182-188.)。普通的qPCR方法虽然能够对致病菌进行定量，但不能区分致病菌的死活(张振家,郁继华,王喜林.黄瓜细菌性角斑病防治试验初报[J].甘肃农业大学学报,1989,4:63-66.；仝铁铮,吴舒旭,李丹,et al.基于PMA-定量PCR选择性检测技术的病原菌消毒特性研究[J].环境科学,2011,32(4):1120-1126.)。有研究表明致病菌在死亡后数天甚至数周内DNA都能够保持完整(Josephson K,Gerba C,Pepper I.Polymerase chain reaction detection of nonviable bacterial pathogens[J].Applied and Environmental Microbiology,1993,59(10):3513-3515.)，因此如何区分病原体的死活就成为分子检测手段的巨大挑战。

综上所述，农业生产中迫切需要构建一种重复性好、耗时短、灵敏度高的致病菌的分子检测方法，这对于农业生产中预防和控制疾病有着很重要的意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种用于定量检测黄化曲叶病毒的引物及其应用。

本发明的发明人经过大量的研究发现，通过将PMA染料与定量PCR结合，使用设计的特异性的引物，可以定量检测作物(例如黄瓜)残体中的活病原体的含量和全部的病原体含量，再经过计算可以得到同一单位质量组织内活的黄化曲叶病毒病所占的百分比。因此，该方法的建立可以成为判断在农业生产中针对患病植株进行处理的有效性的一种手段。