[发明专利]一种胎盘干细胞复合甲壳素组织修复材料的制备方法

权利要求书

1.一种胎盘干细胞复合甲壳素组织修复材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：机械剥除胎盘羊膜组织，将剥离后剩下的绒毛组织，过质量浓度75％的酒精，再用PBS冲洗洗尽血渍，并将其剪成1mm²小块后，浸没于含有质量浓度0.1％的IV型胶原酶的低糖基础培养基中，37℃消化15-45分钟,得细胞组织液；

步骤二：细胞组织液经200目筛网过筛后转移至干净的离心管，1200rpm离心lOmin，弃上清液后接种于含有质量浓度10％的胎牛血清的低糖基础培养基中，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养5天后进行第一次换液，随后每隔两天进行换液，待细胞融合至90％使用质量浓度0.25％的胰酶进行消化，得胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(CMSCs)；

步骤三：将160g甲壳素粉末加入到616mL、46wt％的NaOH溶液,于冰浴中溶胀6h,于-20℃冷冻24h,解冻、过滤,制得甲壳素钠盐溶液；

步骤四：将甲壳素钠盐溶液真空脱泡后于洁净的玻璃板上刮膜,待膜流平后,依次于5wt％CaCl₂和1wt％HCl溶液中凝固30min和5min，取膜，并用去离子水洗净,将湿膜固定于有机玻璃板上自然晾干，得甲壳素膜；

步骤五：取生长状况良好的胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(CMSCs)接种于甲壳素膜上，接种时间为2-12h，即得胎盘干细胞复合甲壳素组织修复材料。

2.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞复合甲壳素组织修复材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤一还包括：将剥离后剩下的绒毛组织制成面积为10cm²。

3.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞复合甲壳素组织修复材料的制备方法，其特征在于：步骤一中所述的PBS中含有质量浓度0.1％的青-链霉素。

4.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞复合甲壳素组织修复材料的制备方法，其特征在于：所述的步骤三中甲壳素粉末的乙酰度和粘均分子量分别为92.5％和1.31×10⁶。

5.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞复合甲壳素组织修复材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤四还包括：将甲壳素膜置于24孔板中，于放射CO⁶⁰辐射消毒。