[发明专利]用于甜瓜果实基因PCR表达分析的内参基因及该内参基因的稳定性验证方法

权利要求书

1.一种用于甜瓜果实基因PCR表达分析的内参基因，其特征在于：所述内参基因为MELO3C007745T1基因，所述内参基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述用于甜瓜果实基因PCR表达分析的内参基因，其特征在于：所述MELO3C007745T1基因的PCR扩增引物核苷酸序列是：

正向引物序列：TCTGGAGGAGTAGGTCGGATACC；

反向引物序列：CGATCAATGACGCAACAAGGCA。

3.一种权利要求1所述内参基因的稳定性验证方法，其特征在于，它包括以下步骤：

步骤1：在雪里红甜瓜和风味4号甜瓜于授粉后的15、20、25、30和35天的五个采样时间点，分别选取三个生物学重复的雪里红甜瓜和三个生物学重复的风味4号甜瓜果实，每个生物学重复的雪里红甜瓜选取两株，每个生物学重复的风味4号甜瓜也选取两株，即一共采集30株雪里红甜瓜果实和30株风味4号甜瓜果实；

步骤2：用植物RNA提取试剂分别分离以上30株雪里红甜瓜果实和30株风味4号甜瓜果实的总RNA，每个上述总RNA均需满足A260/A280在1.8～2之间以及A260/A230在1.8～2之间；且每个上述总RNA均需要通过完整性检测，对每个上述总RNA进行反转录反应得到对应的每个cDNA；

步骤3：分析雪里红甜瓜果实转录组数据和风味4号甜瓜果实转录组数据，在雪里红甜瓜果实转录组数据和风味4号甜瓜果实转录组数据中分别选取如下共有核苷酸序列：

MELO3C026953T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：4、MELO3C002234T2，核苷酸序列见SEQ ID NO：5、MELO3C007745T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：3、MELO3C008016T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：6、MELO3C009005T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：7、MELO3C021785T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：8、MELO3C015496T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：9、MELO3C013938T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：10，CmRPL和CmRPS15作为候选内参基因；

步骤4：将上述8种候选内参基因进行引物设计得到8种对应的引物，并保证各个引物的扩增产物长度控制在80-150bp之间，用上述8种引物均对每个cDNA进行常规PCR扩增得到每个cDNA对应的PCR扩增产物，对每个PCR扩增产物进行凝胶电泳检测检验上述每个引物是否扩增出有效的唯一的条带；

步骤5：将引物稀释至不同倍数后对所有上述获得的cDNA进行qRT-PCR实验，以引物的拷贝数的对数值为横坐标，扩增达到阈值时的循环数Ct值为纵坐标绘制引物标准曲线，并得到引物的扩增效率和扩增达到阈值时的循环数；

步骤6：采用geNorm软件分析上述候选内参基因的稳定性，表达最稳定的一对候选内参基因是MELO3C008016T1，MELO3C009005T1，其次是MELO3C007745T1，最不稳定的是CMRPS15；

步骤7：对上述所有候选内参基因在每个样本中的扩增效率和扩增达到阈值时的循环数用NormFinder软件计算基因表达稳定值M，根据得到的所有基因表达稳定值M的到上述所有候选内参基因的稳定性的排列顺序依次是：MELO3C008016T1﹥MELO3C007745T1﹥MELO3C009005T1﹥MELO3C002234T2﹥MELO3C013938T1﹥MELO3C021785T1﹥MELO3C015496T1﹥CmRPL﹥MELO3C026953T1﹥CmPRS 15；上述样本为步骤1中采集的30株雪里红甜瓜和30株风味4号甜瓜；

步骤8：使用BestKeeper软件计算所有候选内参基因的扩增达到阈值时的循环数的标准差SD和变异系数CV，以及各候选内参基因间的泊松相关系数R，以此来确定候选内参基因的表达稳定性，标准差SD小于1的候选内参基因被认为是稳定表达的基因，标准差SD越小，变异系数CV越小，该候选内参基因越稳定，泊松相关系数R值越大的候选内参基因越稳定；反之，则越不稳定，上述所有候选内参基因中，MELO3C026953T1基因为最稳定的候选内参，其次是MELO3C008016T1、MELO3C002234T2、MELO3C007745T1和MELO3C009005T1；

步骤9：利用geNorm、NormFinder和BestKeeper三个内参筛选软件综合分析各候选内参基因的稳定性排序，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper三个内参筛选软件得到的共同的稳定性最好的前四个的候选内参基因依次是MELO3C008016T1、MELO3C009005T1、MELO3C007745T1和MELO3C002234T2，共同的稳定性最差的前两个候选内参基因顺序依次是CmPRS15和CmRPL。

4.根据权利要求3所述的内参基因的稳定性验证方法，其特征在于：所述步骤9后还包括步骤10，步骤10：分析上述所有样本的蔗糖代谢相关的基因CmAIN2和CmSPS基因的表达模式，通过对CmAIN2和CmSPS的表达分析来验证筛选出的内参基因的稳定性；

在CmAIN2和CmSPS基因的表达中，用CmPRS15作为内参基因时，表达量差异幅度较大，可能导致目标基因的表达量估计不准，利用单独基因MELO3C007745T1，2个基因组合MELO3C008016T1和MELO3C009005T1，3个基因组合作MELO3C007745T1和MELO3C008016T1以及MELO3C009005T1为内参基因时表达量正常，考虑到2个基因组合MELO3C008016T1和MELO3C009005T1，3个基因组合MELO3C007745T1和MELO3C008016T1以及MELO3C009005T1更复杂，不利于简化实验操作，所以确定单独基因MELO3C007745T1作为筛选得到的最终内参基因。