[发明专利]用于甜瓜果实基因PCR表达分析的内参基因及该内参基因的稳定性验证方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地指一种用于甜瓜果实基因PCR表达分析的内参基因及该内参基因的稳定性验证方法。

背景技术

基因表达分析是研究基因功能和转录水平调控的重要手段。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)因具有高灵敏性、高特异性、高精确性和成本较低等的特点，被广泛应用于基因表达的定量分析。在qRT-PCR分析中，为了获得目标基因表达水平的真正差异，需要消除不同样本RNA产量、质量以及反转录效率上存在的差异。消除样本间的差异通常情况下是采用内参基因进行校正和标准化，即通过分别测定目的基因以及内参基因的表达量，将内参基因表达量作为一个标准来计算出目的基因的相对表达量，再比较样品间相对表达量的差异。相对定量方法简单、准确、高效，应用十分广泛，但需要选择合适的内参基因。理想的内参基因应该是在所有的样本中均表达稳定，因此，利用qRT-PCR对目标基因进行相对定量的准确性依赖于使用经过系统验证的、表达稳定的内参基因。

甜瓜是葫芦科甜瓜属植物，是一种重要的经济作物。中国甜瓜收获面积和总产量均居世界第一。利用基因表达分析的方法挖掘甜瓜优异基因和调控网络，是进行甜瓜遗传改良的前提。目前在甜瓜基因表达分析中使用的多是传统的内参基因，这些传统内参基因并未经过系统验证，稳定性较差，从而导致甜瓜基因表达分析的准确性较差。

发明内容

本发明的目的是为了提高甜瓜基因表达分析的准确性，从甜瓜果实转录组数据中挖掘出一批表达较稳定的基因，并进一步比较了这些基因在不同果实发育时期中的表达稳定性，最终筛选出适于甜瓜果实基因表达分析的稳定的内参基因。

为实现此目的，本发明所设计的一种用于甜瓜果实基因PCR表达分析的内参基因，所述内参基因为MELO3C007745T1基因，所述内参基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。

上述MELO3C007745T1基因的PCR扩增引物核苷酸序列是：

正向引物序列：TCTGGAGGAGTAGGTCGGATACC；

反向引物序列：CGATCAATGACGCAACAAGGCA。

一种上述内参基因的稳定性验证方法，其特征在于，它包括以下步骤：

步骤1：在雪里红甜瓜和风味4号甜瓜于授粉后的15、20、25、30和35天的五个采样时间点，分别选取三个生物学重复的雪里红甜瓜和三个生物学重复的风味4号甜瓜果实，每个生物学重复的雪里红甜瓜选取两株。每个生物学重复的风味4号甜瓜也选取两株，即一共采集30株雪里红甜瓜果实和30株风味4号甜瓜果实；

步骤2：用植物RNA提取试剂分别分离以上30株雪里红甜瓜果实和30株风味4号甜瓜果实的总RNA，每个上述总RNA均需满足A260/A280在1.8～2之间以及A260/A230在1.8～2之间；且每个上述总RNA均需要通过完整性检测，对每个上述总RNA进行反转录反应得到对应的每个cDNA；

步骤3：分析雪里红甜瓜果实转录组数据和风味4号甜瓜果实转录组数据，在雪里红甜瓜果实转录组数据和风味4号甜瓜果实转录组数据中分别选取如下共有核苷酸序列：

MELO3C026953T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：4、MELO3C002234T2，核苷酸序列见SEQ ID NO：5、MELO3C007745T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：3、MELO3C008016T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：6、MELO3C009005T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：7、MELO3C021785T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：8、MELO3C015496T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：9、MELO3C013938T1，核苷酸序列见SEQ ID NO：10，CmRPL和CmRPS15作为候选内参基因；

步骤4：将上述8种候选内参基因进行引物设计得到8种对应的引物，并保证各个引物的扩增产物长度控制在80-150bp之间，用上述8种引物均对每个cDNA进行常规PCR扩增得到每个cDNA对应的PCR扩增产物，对每个PCR扩增产物进行凝胶电泳检测检验上述每个引物是否扩增出有效的唯一的条带；

步骤5：将引物稀释至不同倍数后对所有上述获得的cDNA进行qRT-PCR实验，以引物的拷贝数的对数值为横坐标，扩增达到阈值时的循环数Ct值为纵坐标绘制引物标准曲线，并得到引物的扩增效率和扩增达到阈值时的循环数；