[发明专利]一种用于冬虫夏草真伪鉴定的二重PCR检测方法

权利要求书

1.一种用于冬虫夏草真伪鉴定的二重PCR检测方法，其特征在于：在同一个PCR反应体系中同时检测冬虫夏草中虫草菌的ITS和所述虫草菌寄主的COI基因核酸片段，用于鉴定所述COI基因核酸片段的扩增引物组为：

COI-F：GGAAATCCHGGATCTTTAATT

COI-R：GATGCCCCMGARTGTGCAAT；

用于鉴定所述ITS的扩增引物组为：

CITS-F10’：GTTGCCTCGGCGGGAC

CITS-R10’-2：CMTTTGCTTGCTTCTTGACTGAG；

所述检测方法包括以下步骤：

步骤1：合成引物组：合成所述用于鉴定ITS的扩增引物组和用于鉴定COI基因核酸片段的扩增引物组；

步骤2：制备待检测样品DNA稀释液、阳性对照品DNA稀释液、以及空白对照液；

步骤3：配制PCR反应体系；

步骤4：PCR及电泳检测；

其中，所述步骤4中的电泳检测为将PCR反应后所得的扩增产物用2.5 %琼脂糖凝胶70V电泳40 min后凝胶成像仪照相分析，若阳性对照和待检测样品均扩增出113 bp和302 bp两条目标条带，而空白对照未出现条带，则可判定待检测样品中含有冬虫夏草成分；若阳性对照扩增出113 bp和302 bp两条目标条带，空白对照未出现条带，待检测样品未扩增出条带，则可判定待检测样品中不含有冬虫夏草成分。

2.根据权利要求1所述的一种用于冬虫夏草真伪鉴定的二重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤1合成的引物浓度均为10 µmol/l。

3.根据权利要求2所述的一种用于冬虫夏草真伪鉴定的二重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤2中待检测样品DNA稀释液和阳性对照品DNA稀释液的浓度均为50 ng/µl。

4.根据权利要求3所述的一种用于冬虫夏草真伪鉴定的二重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤3中配制PCR反应体系，即将步骤2所得的DNA稀释液加入到25 µl PCR反应体系中，所述PCR反应体系包括以下组分：

2×Taq PCR Master mix 12.0 µl

引物COI-F 1.0 µl

引物COI-R 1.0 µl

引物CITS-F10’ 1.0 µl

引物CITS-R10’-2 1.0 µl

DNA稀释液 1.0 µl

水 8.0 µl。

5.根据权利要求4所述的一种用于冬虫夏草真伪鉴定的二重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤4中PCR的反应条件为：95℃预变性5~10 min，1个循环；95℃变性15 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；然后延展72℃延伸5~7 min。