[发明专利]一种用于冬虫夏草真伪鉴定的二重PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种用于冬虫夏草真伪鉴定的二重PCR检测方法，解决了现有技术中仅针对真菌来进行冬虫夏草鉴定从而缺乏足够准确性的问题。本发明在同一PCR反应体系中同时检测虫草菌的ITS和虫草菌寄主的COI基因核酸片段，用于鉴定所述COI基因核酸片段的扩增引物组为：COI‑F：GGAAATCCHGGATCTTTAATTCOI‑R：GATGCCCCMGARTGTGCAAT；用于鉴定所述ITS的扩增引物组为：CITS‑F10’：GTTGCCTCGGCGGGACCITS‑R10’‑2：CMTTTGCTTGCTTCTTGACTGAG。本发明方法操作简便，针冬虫夏草的鉴别特异性强，准确度高，重复性好，适宜推广。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于冬虫夏草真伪鉴定的二重PCR检测方法。

背景技术

冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis sym.Cordyceps) 为麦角菌科真菌冬虫夏草菌寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾幼虫上的子座(子实体) 及幼虫尸体的复合体。它是药食两用的名贵滋补药材，主要分布于青藏高原海拔3000 m的雪线以上的地区，具有补肺益肾、平喘祛痰、镇静提神、强心壮血的功效，在增强免疫力、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化炎症等方面均具有较好的药理作用，具有极高的药用和经济价值。由于其对生长地理环境的特殊要求，及其严格的寄生性，无法进行人工培植和规模化生产替代，自然资源十分稀少，市场供给极为短缺。加之近年来对野生虫草的过渡采挖极大地破坏了虫草生境，虫草资源逐年骤减，使其得显得十分珍贵，价格昂贵。在利益的驱使下，不法商贩采取掺假、造假的手段牟利，从而使市场上充斥着各种各样的伪品。常见的有亚香棒虫草、凉山虫草、新疆虫草、地蚕及模制仿品等，这些伪品外观与冬虫夏草相似，但药用价值和营养价值相差甚远，对虫草的用药安全造成极大的威胁。因此，冬虫夏草真伪鉴定对于肃清和纯净市场，维护消费者权益具有非常重要的意义。

近些年，随着中药鉴定学研究和中药标准化进程的不断发展，中药鉴定新技术、新方法不断应用，尤其分子生物学方法的引入，中药品种混乱的现象得到了极大的改观。冬虫夏草真伪鉴定可通过性状鉴定法、显微鉴定法、理化鉴定法等传统鉴定方法以及近年来发展的分子技术来实现。由于虫草性状及其中活性成分含量受到其生长条件、采收时间、贮藏等因素的影响而发生变化，采用传统方法容易受到干扰而影响鉴定结果的准确性。且传统的这几种方法对亲缘关系较近的物种难以区分，且需要长期经验积累，鉴定结果受主观判断力影响极大，或受专业领域的局限。以核酸和蛋白为基础的分子检测技术具有专一性强、灵敏度高、操作简单等优点，且不受个体形态、大小和完整性的影响，目前已广泛用于检测及鉴定工作中。但目前冬虫夏草真伪鉴定分子检测技术的报道很少，现有的相关研究主要集中于其无性型的分离和鉴定(杨静，2005；Liang et al.，2008; Zhong et al.，2010；Leiet al.，2013)。2015年陈士林报道了采用DNA条形码技术对冬虫夏草真实性进行鉴定的方法，采用真菌通用ITS5F/4R引物得到ITS2序列，通过与数据库中冬虫夏草ITS2序列比对来鉴定受检样品的真实属性。冬虫夏草是一种复型真菌，根据其所处的不同阶段，分为有性型(子囊孢子阶段)和无性型(分生孢子阶段)。通常所指的冬虫夏草是它的有性型，换句话说，体现其商品性的是整个菌与虫复合体。同一种真菌寄生于不同寄主上，或不同种真菌寄生于同一寄主上，产生的外形相似的复合体就可能作为伪品与正品混淆，而这样的情况极大可能出现在冬虫夏草与其伪品之间。因此，仅针对其真菌（包括其无性型）进行鉴定来判断冬虫夏草真伪是不够的，应该同时结合对其寄主的鉴定。

因此同时针对冬虫夏草中虫草菌及其寄主蝙蝠蛾特异核酸片段，建立一种准确性高，简单适用，易于推广的冬虫夏草高特异性PCR检测方法，可以有效区别冬虫夏草与伪品，或探及含有冬虫夏草成分的产品，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容