[发明专利]一种羊的长绒毛及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种羊的长绒毛及其制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

羊的绒毛是一种稀有的珍贵动物纤维，羊的长绒毛主要用于纺织行业，绒毛长度增长可以提高羊的产绒毛量并且在纺织过程中更便于加工。目前国内市场主要通过实际生产中提高绒山羊的营养和改善养殖条件或者寻找绒毛长度显著增长的个体进行人工选育来培养绒山羊绒毛长度显著增长的品种，但现有的人工选育方法增长效果不大明显。因此，若想有效改善此问题，提高绒毛的利用率和纺织性能，生物工程手段是一种可尝试的途径，但利用基因改造手段使羊的绒毛长度显著增长的方法目前并没有被报道。

此外，目前并未明确对羊的绒毛长度起到重要作用的基因具体包括哪些基因，且现有的基因敲除的手段主要是RNA干扰、同源重组、talen、CRISPR/Cas9系统，存在因添加针对真核细胞的药物筛选标记而导致的增加出生后动物耐药性的风险，而且添加药物筛选会增加细胞毒性影响胚胎后续的发育，造成克隆效率低，阳性克隆成活率低等缺点。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种碱基缺失的基因FGF5，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供携带所述FGF5基因的载体或定点删除FGF5基因片段的基因编辑细胞系。

在本发明的一种实施方式中，所述定点删除FGF5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供一种羊的长绒毛，所述绒山羊的FGF5基因失活而使其绒毛显著增长。

本发明的第四个目的是提供一种制备所述长绒毛的方法，是构建无标记基因的载体，经过体细胞核移植，制备失活SEQ ID NO.1所示FGF5基因的克隆羊，以获得的克隆羊生产长绒羊毛。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

(1)构建针对真核细胞的无荧光标记或药物筛选标记的FGF5基因定点敲除载体；

(2)将该载体转染F5代以内的绒山羊成纤维细胞，利用提高转染效率、挑选单个细胞扩大培养，酶切鉴定，测序分析方法筛选出阳性克隆；

(3)利用体细胞核移植的方法将阳性细胞移植到去核卵细胞中，融合、激活、发育后移植到同期母羊体内相应部位；

(4).基因编辑绒山羊出生后在羊毛生长休止季节采集绒毛进行绒毛长度检测；

(5)提取长度增长的绒毛基因，获得目的基因。

本发明的第五个目的是提供一种生产所述长绒毛的羊的制备方法，所述方法是通过基因编辑技术制备携带碱基缺失FGF5基因的基因编辑羊。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供了一种长度增长的羊绒毛，其绒毛长度达101.3mm，比现有技术增加了6.5mm；羊毛长度可达192.62mm，比现有技术增加了18.31mm，且传代稳定，妊娠率达80％以上，比现有技术的8.7～25％提高了至少3倍。

2、本发明克服了现有技术的偏见，摒弃了在载体上携带药物筛选标记或荧光标记的方法，设计了无药物筛选和荧光标记基因的定点敲除FGF5基因的载体，获得了羊绒羊毛都显著增长的定点敲除FGF5基因的绒山羊，与现有的技术相比，本发明的优点是实现了安全、定点、100％敲除FGF5基因，相比于传统育种方法筛选长绒山羊的长期性和不确定性，本方法更加省时、精准。与传统基因编辑育种方法相比，本发明更加安全，高效，成活率更高。

附图说明

图1为本发明的重组质粒构建图。

具体实施方式

实施例1合成无标记基因的载体

本研究对绒山羊FGF5的cDNA序列共设计3个TALE靶位点，并且这3个靶位点全部位于FGF5基因的第一外显子上。即通过DNA识别模块将TALEN元件靶向特异性的DNA位点并结合，在FokI核酸酶的作用下完成表1中设计的位点的剪切，并借助于细胞内固有的同源定向修复(HDR)或非同源末端连接途径(NHEJ)修复过程完成FGF5序列基因缺失。

表1 TALEN质粒的靶位点

实施例2细胞转染