[发明专利]用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对组、探针、试剂盒及方法

说明书

本发明提供的一种用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对组，包括第一引物对、第二引物对以及第三引物对；所述第一引物对的序列分别如SEQ ID No.s1和2所示；所述第二引物对的序列分别如SEQ ID No.s3和4所示；所述第三引物对的序列分别如SEQ ID No.s5和6所示。能够一次性区分鉴定出阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌、穆汀斯克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌以及苏黎世克罗诺杆菌中的任意一种，检测灵敏度高，可确保结果的准确性，鉴定快速、成本低，能够进行广泛的应用。

技术领域

本发明涉及食品微生物检测技术领域，特别是一种涉及用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对组、探针、试剂盒及方法。

背景技术

克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)原名为阪崎肠杆菌，可以通过污染婴幼儿奶粉而引起新生儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和败血症等，严重可导致死亡或预后留有神经系统后遗症、发育障碍。虽然早在1958年就有感染病例，但一直被误认为是阴沟肠杆菌,直到1980年才被正式命名为阪崎肠杆菌。2008年，艾弗森(Iversen)等人将原来的阪崎肠杆菌，大肠杆菌科里的一个“种”，重新划分为一个“属”，并命名为克罗诺杆菌属。到目前为止，研究报道“属”内一共分有7个“种”，分别为阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌(C.malonaticus)、穆汀斯克罗诺杆菌(C.muytjensii)、都柏林克罗诺杆菌(C.dublinensis)、苏黎世克罗诺杆菌(C.turicensis)、尤尼沃斯克罗诺杆菌(C.universalis)和康帝蒙提克罗诺杆菌(C.condimenti)，其中，常见的为前五种。

2011年克鲁兹(Cruz)等人将不同“种”克罗诺杆菌的菌株进行了细胞粘附和侵袭实验，发现不同“种”克罗诺杆菌的菌株表现的细胞毒性有差异；再者，分子流行病学研究结果也表明不同“种”克罗诺杆菌的不同基因型(sequence types，STs)的菌株可能具有不同的致病力，例如ST 4的阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)是引起新生儿脑膜脑炎主要型别。因此，在“属”水平对各个“种”进行区分并鉴定在目前克罗诺杆菌研究中尤为重要。

传统的分种方法依赖于生理生化和形态学特点，但是这种方法操作繁琐、耗时长、不易分辨结果，而且存在一定假阳性情况，所以逐渐被淘汰。随着分子生物学技术的成熟发展，分子检测的方法被广泛应用。

2009年Stoop等利用普通PCR方法进行了克罗诺杆菌属内各个“种”的鉴定，该方法选用rpoB基因作为目标检测基因，然而由于阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)和丙二酸盐阳性克罗诺杆菌(C.malonaticus)的rpoB基因具有高同源性，因此还需要再设计一对引物才能将两者区别。HUANG C H等利用DNA促旋酶B亚基基因设计引物，建立了一种只能用于区别阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)和都柏林克罗诺杆菌(C.dublinensis)的普通PCR检测方法。CaiXianquan等利用外膜蛋白基因ompA基因建立了针对克罗诺杆菌属的荧光定量PCR方法，在荧光定量PCR反应结束后对PCR产物进行高分辨率溶解曲线的生成，根据溶解曲线的差异从而将克罗诺杆菌属内不同“种”的菌株区别。Stephan等利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)质谱鉴定方法将克罗诺杆菌属菌株鉴定到“种”的水平，还有多位点序列分型(MLST)通过测序并将将序列进行分析后，也可以鉴定各个“种”。

但是上述方法或流程比较多，成本比较高，或者缺乏直观判定性，或鉴定周期长，因此均未能得到广泛的应用。

发明内容

基于此，有必要针对鉴定成本高、流程繁琐、无法直观判定克罗诺杆菌属各个“种”的方法，提供一种用于鉴定克罗诺杆菌属各个“种”的引物对组、探针、试剂盒及方法。