[发明专利]一种地黄蛋白纳米颗粒及其制备方法

权利要求书

1.一种地黄蛋白纳米颗粒，其特征在于：由两个地黄蛋白组成，由13个地黄蛋白DHP1单体和11个地黄蛋白DHP2单体形成一个球状的蛋白纳米颗粒；所述的地黄蛋白DHP1和DHP2的N-端一级结构序列分别为SEQ ID NO:1：R-E-K-D-I-A-G-A-V-Q-T-V和SEQ ID NO:2：R-E-K-D-I-V-X；

所述的地黄蛋白提取方法，具体包括以下步骤：

1）地黄蛋白粗提液的制备：鲜地黄经榨汁机、生地或熟地黄原料经高速粉碎机将其磨碎，料液比1:3加入0.2 mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液混合均匀，置于4℃，搅拌浸提24 h；用8层纱布过滤得到的地黄浸提液，弃去滤渣，将滤液在4 ℃下经15000rpm离心20 min，收集上清液；在4℃磁力搅拌条件下，向地黄蛋白抽提液中缓慢加入无水硫酸铵，使溶液盐浓度达到20%，待完全溶解后，4℃下静置4 h，以12000 rpm离心20 min，收集上清液；继续向收集的上清液中缓慢加入无水硫酸铵至饱和度为40%，待完全溶解后，于之前同样步骤收集上清液；继续向上清液加入硫酸铵至饱和度为60%，待固体全溶后，于之前同样步骤收集上清液；继续向上清液加入硫酸铵至饱和度为80% ，待固体全溶解后，4 ℃下放置4h，15000 rpm离心20 min，收集沉淀；沉淀用0.2 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液充分溶解后以相同浓度pH7.0磷酸缓冲液透析12h，将透析液在15000 rpm，4℃条件下，离心20 min，收集上清液，得到的溶液即为地黄蛋白粗提液；

2）地黄蛋白DHP1的离子交换色谱分离：将100mL地黄蛋白初提液流加至以0.02 mol/L、pH4.6的醋酸-三水合醋酸钠缓冲液平衡的CM-Sephadex C-50弱阳离子常压色谱柱，以同样浓度醋酸-三水合醋酸钠缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～1 mol/L NaCl的0.02mol/L、pH4.6的醋酸-三水合醋酸钠缓冲液线性梯度洗脱300 mL，最后用1 mol/L NaCl 的0.02 mol/L、pH4.6的醋酸-三水合醋酸钠缓冲液洗脱1个柱体积，流速0.5mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定，获得P0蛋白组分；将经CM-Sephadex C-50分离且透析过的P0蛋白组分进一步用Source-15Q高效液相色谱柱进行分离，5ml加至以0.02 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液平衡的Source-15Q色谱柱，以同样浓度的磷酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～01mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液线性梯度洗脱20 mL，最后用含1 mol/LNaCl 的0.02 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液洗脱1个柱体积，流速1 mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定；

3）地黄蛋白DHP2的二步疏水色谱分离：将地黄蛋白粗提液进一步用疏水色谱POROS 20Micron HP2进行纯化，疏水色谱柱以含有2 mol/L（NH₄）₂SO₄的0.02 mol/L、pH7磷酸缓冲液平衡，以2～0 mol/L（NH₄）₂SO₄的0.02 mol/L、pH7的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液进行线性梯度洗脱；流速2.0 mL/min，上样量：5 mL，紫外检测波长280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定；将第一次疏水色谱分离得到的蛋白组分按上述相同条件进行第二次疏水色谱分离，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定；

4）地黄蛋白的基本性质表征：以SDS-PAGE测定该经纯化得到的地黄蛋白的分子量大小，以等电点聚焦测定该地黄蛋白的等电点，以Edman degradation测定地黄蛋白的N-端一级结构序列。

2.根据权利要求1所述的一种地黄蛋白纳米颗粒，其特征在于：该纳米颗粒其平均粒径为120.61±0.46 nm，表面电荷呈负性，范围在-18±5mV。