[发明专利]一种地黄蛋白纳米颗粒及其制备方法

说明书

本发明公开了一种地黄蛋白及其纳米颗粒的制备方法，颗粒由两个蛋白组成，两个地黄蛋白的N‑端一级结构序列分别为SEQ ID NO:1：R‑E‑K‑D‑I‑A‑G‑A‑V‑Q‑T‑V和SEQ ID NO:2：R‑E‑K‑D‑I‑V‑X。本发明涉及的地黄蛋白提取分离于鲜地黄、生地黄或熟地黄中，在这些传统使用的地黄原料中稳定存在；其纳米颗粒的制备方法不涉及任何交联剂，且其成品广泛存在于各类使用地黄为原料加以传统热加工工艺制作的汤剂中，为广大人群服用多年，安全性高。本发明涉及的地黄蛋白纳米颗粒除安全高效发挥自身功效外，还有望与其它原料配伍，高效协同发挥作用。

技术领域

本发明涉及医药技术领域中的蛋白药物新剂型和制剂技术，具体涉及到一种地黄蛋白纳米颗粒及其制备方法。

背景技术

近几十年来，纳米颗粒研究广泛，经过材料的纳米化后，纳米材料的物化性质（光学、电学、表面活性等）均会呈现与原始材料截然不同的性质，有靶向性和穿透性等优点的同时，也暴露出在生物相容性、细胞毒性和可降解性方面的缺点。目前应用于纳米药物载体研究的生物大分子（如血清白蛋白、丝蛋白等）皆没有可以参照的天然研究模型，获得纳米颗粒的物化性质及其相关生物安全性也需要长期的观测，才能得到全面评估。纳米药物载体发展带来的潜在风险引起了科学界广泛的担忧。

地黄是一种我国人民长期使用的食品原料和中药药材，地黄在中药汤剂，特别是中药复方汤剂中具有非常重要的用途。地黄来源于玄参科植物地黄（Rehmannia glutinosaLibosch）的块根，具有调节免疫、抗肿瘤、抗辐射、保护胃粘膜、抗衰老等药理作用，临床上用于止血，并用于治疗糖尿病、心脑血管疾病及高血压等。鲜地黄中梓醇含量较高，约为5.33%，相当于生地黄的10倍，熟地黄的35倍，鲜地黄和生地黄性寒，味甘苦，清热生津，凉血止血，养阴生津；熟地黄糖基化蛋白含量高，性微温，味甘，滋阴补血，益精填髓。由于地黄药理作用的多样性及临床应用的广泛性，值得进一步深入研究和开发。但是到目前为止，有关地黄蛋白纳米颗粒的研究国内外尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种地黄蛋白纳米颗粒及其制备方法。针对化合物在纳米化后，在安全性上的不确定性，本发明涉及的地黄蛋白纳米颗粒的设计从两个“天然”体系出发：一是天然存在于食品中的蛋白质成分，二是该蛋白质的纳米化过程发生在热加工过程，其纳米颗粒存在于各种传统加工汤剂中被广泛服用。本发明得到的地黄蛋白纳米颗粒体外细胞实验显示了极低毒性，强抗氧化活性，表面规则，粒径分布均匀，稳定性好。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种地黄蛋白纳米颗粒，由两个地黄蛋白组成，由13个地黄蛋白DHP1单体和11个地黄蛋白DHP2单体形成一个球状的蛋白纳米颗粒；所述的地黄蛋白DHP1和DHP2的N-端一级结构序列分别为SEQ ID NO:1：R-E-K-D-I-A-G-A-V-Q-T-V和SEQ ID NO:2：R-E-K-D-I-V-X。

2、根据权利要求1所述的一种地黄蛋白纳米颗粒，其特征在于：该纳米颗粒其平均粒径为120.61±0.46 nm，表面电荷呈负性，范围在-18±5mV。

所述的地黄蛋白分子量分别为26.2 kDa（DHP1）和18.1KDa（DHP2）；等电点分别为8.0（DHP1）和5.2（DHP2）。

两个地黄蛋白的提取方法，经过磷酸盐缓冲液水相抽提后，DHP1经过弱阳离子交换色谱CM-Sephadex C-50和高效液相色谱Souce-15Q分离；DHP2经过两步POROS 20 MicronHP2疏水色谱分离，从地黄中得到两个电泳纯的地黄蛋白。其具体包括以下步骤：