[发明专利]澳洲坚果的组织培养方法

权利要求书

1.一种澳洲坚果的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、剪取澳洲坚果成年结果树的结果枝当年抽生枝条，切下梢基部的发育未完全的叶，取叶腋里带芽的叶作外植体，用1g/L升汞浸泡3min后用无菌水冲洗，重复5次；

步骤二、接入第一固体培养基进行初代培养10天，培养温度为25℃、光照12h/天，其中，自然光照6h、光照强度2000lux，人工光照6h、光通量密度为80μmol/m²·s，第一固体培养基为1/2MS、7g/L的琼脂、15g/L的蔗糖、2g/L的碳粉、15g/L的糖蜜发酵液、15mg/L的蛋白胨，pH为5.8；

步骤三、接入第二固体培养基进行继代培养60天，培养温度为25℃、光照12h/天，其中，自然光照5h、光照强度2000lux，人工光照7h、光通量密度为80μmol/m²·s，第二固体培养基为1/2MS、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、10mg/L的赤霉素、15g/L的琼脂、15g/L的蔗糖、15g/L的糖蜜发酵液、2g/L的肌醇、1mg/L的烟酸、5mg/L的多效唑，pH为5.8；

步骤四、接入第三固体培养基进行生根培养30天，培养温度为25℃、光照12h/天，其中，自然光照4h、光照强度2000lux，人工光照8h、光通量密度为80μmol/m²·s，第三固体培养基为1/2MS、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、1.0mg/L的赤霉素、2mg/L的吲哚丁酸、15g/L的琼脂、15g/L的蔗糖、15g/L的糖蜜发酵液、1mg/L的盐酸硫胺素、2g/L的肌醇、1mg/L的钼酸钠、5mg/L的硼酸，pH为5.8；

步骤五、接入第四固体培养基再次进行生根培养30天，培养温度为25℃、光照12h/天，其中，自然光照3h、光照强度2000lux，人工光照9h、光通量密度为80μmol/m²·s，第四固体培养基为1/2QL、2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、1.0mg/L的赤霉素、2mg/L的吲哚丁酸、5mg/L的萘乙酸、15g/L的蔗糖、15g/L的糖蜜发酵液、2mg/L的盐酸吡哆醇、80mg/L的乙二胺四乙酸二钠，pH为5.8；

其中，步骤二～五均在组培箱中进行，组培箱中设置等数量的黄光灯管与紫光灯管，黄光灯管的波长为580nm，紫光灯管的波长为410nm，步骤二的人工光照时，黄光灯管与紫光灯管的启动数量比为1:1，期间喷布雾化的液体培养基，喷布10min、暂停5min，重复4次，步骤三的人工光照时，黄光灯管与紫光灯管的启动数量比为5:7，期间喷布雾化的液体培养基，喷布15min、暂停5min，重复6次，步骤四的人工光照时，黄光灯管与紫光灯管的启动数量比为1:2，期间喷布雾化的液体培养基，喷布20min、暂停10min，重复6次，步骤五的人工光照时，黄光灯管与紫光灯管的启动数量比为1:3，期间喷布雾化的液体培养基，喷布30min、暂停10min，重复6次，所述液体培养基为1/2MS、20g/L的蔗糖。

2.如权利要求1所述的澳洲坚果的组织培养方法，其特征在于，还包括：

步骤六、将生根幼苗置于25℃下炼苗7天，去除幼苗根部的培养基，移栽至灭菌处理的砂床基质中，并在其上部铺盖一层聚乙烯膜，并每隔5天掀开聚乙烯膜通风5h。

3.如权利要求1所述的澳洲坚果的组织培养方法，其特征在于，所述组培箱包括：

箱体，其包括四根立柱与八根横柱形成的横截面为方形的框架结构；

盖体，其铰接在所述箱体的一根横柱上，形成可封闭或敞开的盖，所述盖体朝向所述箱体内部的表面上设有联通的雾化喷嘴与储液盒，所述储液盒内储存有液体培养基；

四个培养盘，其自上而下铰接在所述箱体的同一根立柱上，所述培养盘的高度与所述立柱的高度比为1:4，所述培养盘的横截面与所述箱体的横截面投影重合，所述培养盘的侧壁上均匀分布有黄光灯管与紫光灯管，且其中一对侧壁上相对设有长条形散热孔，所述培养盘的底部以多个行和列的形式设有多个培养皿，位于上方的三个培养盘的行与列之间均设有透气孔，且自上至下尺寸依次减小。

4.如权利要求3所述的澳洲坚果的组织培养方法，其特征在于，所述培养盘上设有3×3的培养皿，所述透气孔为井字形，位于上方的三个培养盘透气孔的宽度自上至下的比例为3:2:1。