[发明专利]一种合成D-乳酸的重组菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种合成D-乳酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae为出发菌株，将肺炎克雷伯氏菌基因组的乙酰乳酸合成酶基因budB、乙醇脱氢酶基因adhE和乙酸激酶基因ackA进行敲除得到的；所述乙酰乳酸合成酶基因budB在NCBI的基因ID为11848061；所述乙醇脱氢酶基因adhE在NCBI的基因ID为11848216；所述乙酸激酶基因ackA在NCBI的基因ID为11848786。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是在肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955的基础上构建得到的。

3.一种权利要求1或2任一所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以肺炎克雷伯氏菌乙酰乳酸合成酶基因budB上下游500个碱基片段为模板设计引物，PCR扩增乙酰乳酸合成酶基因budB上下游片段，再利用回收试剂盒回收目的基因片段；

2)以步骤1)回收的基因片段为模板进行搭桥PCR，再利用回收试剂盒回收目的片段ΔbudB；

3)对步骤2)所获得的基因片段ΔbudB和自杀质粒pRE112进行酶切，并回收目的片段和载体；

4)将步骤3)所得的载体和目的片段按照等摩尔比混合后利用连接酶连接，并转入感受态细胞中，筛选阳性克隆；

5)将步骤4)所获得的的阳性克隆进行培养，提取质粒即为重组载体，并转化到E.colix7213得到大肠杆菌重组菌；

6)将步骤5)所获得的大肠杆菌重组菌与野生型肺炎克雷伯氏菌共同培养，通过重组载体与肺炎克雷伯氏菌进行同源重组，获得敲除budB基因的基因缺失型菌株K.penumoniaeΔbudB；

7)利用步骤1)到步骤6)的方法，在K.penumoniaeΔbudB的基础上敲除adhE基因，获得budB、adhE同时缺失的菌株K.penumoniaeΔbudBΔadhE；

8)利用步骤1)到步骤6)的方法，在K.penumoniaeΔbudBΔadhE的基础上敲除ackA基因，获得budB、adhE、ackA同时缺失的菌株K.penumoniaeΔbudBΔadhEΔackA，获得重组菌。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4)所述连接酶为T4 DNA连接酶，连接时间为6h～12h。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的感受态细胞为E.coli cc118感受态细胞或者E.coli DH5α感受态细胞。

6.权利要求1或2任一所述的重组菌在生产D-乳酸中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，活化重组菌制备种子液，然后将种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐中，于30℃～37℃、200rpm～400rpm、通气量0.5vvM～2.5vvM条件下培养24h～48h。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述接种是将种子液和发酵培养基按照体积比为(1-10)：(100-150)进行接种。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述培养的过程中通过分批补料，使葡萄糖的含量维持在1g/L～5g/L；所述培养的过程中通过加入氨水，使培养基的pH维持在6.8～7.1。