[发明专利]一种合成D-乳酸的重组菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种合成D‑乳酸的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的重组菌是以肺炎克雷伯氏菌为出发菌株，将肺炎克雷伯氏菌基因组的乙酰乳酸合成酶基因budB、乙醇脱氢酶基因adhE和乙酸激酶基因ackA进行敲除得到的。本发明还提供了一种上述重组菌的构建方法，以及在生产D‑乳酸中的应用。本发明的重组菌，具有利用葡萄糖合成D‑乳酸的特点，并且在发酵过程中不需要添加抗生素，降低了生产成本，本发明方法有效提高了肺炎克雷伯氏菌利用葡萄糖生产D‑乳糖的产量和转化率，在5L发酵罐水平下可以得到150.1g/L的D‑乳酸，转化率为96％。本发明所提供的重组菌适用于D‑乳酸的工业生产。

技术领域

本发明涉及一种合成D-乳酸的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

乳酸是一种三碳化合物，从光学性质上，可以分为L-乳酸和D-乳酸。L-乳酸的研究较多，D-乳酸相对较少。D-乳酸是一种重要的平台化合物，被广泛应用于农药、医药、化妆品等行业。光学纯度大于95％的D-乳酸可以作为聚乳酸的优良单体。

聚乳酸是一种性质优良的可降解塑料，主要是由L-乳酸通过聚合反应获得。但是，纯粹的聚L-乳酸或聚D-乳酸，在热力学性质及机械性能等方面存在一定缺陷。将D-乳酸聚合单体以一定比例加入聚L-乳酸后可以得到立构复合物聚乳酸，立构型聚乳酸在材料性能商能够得到明显改善；例如，熔点能够提高50℃左右，而拉伸强度、杨氏模量、断裂伸长率提高到单聚物的两倍以上。全球聚乳酸市场每年约以20％～30％的速率增长，带动了高光学纯度D-乳酸需求量的增加。

D-乳酸的生物合成研究相对较少。传统的发酵菌株以乳酸菌为主，但大多数乳酸菌同时合成L-乳酸和D-乳酸，光学纯度比较差。肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae能够利用甘油合成高光学纯度的D-乳酸，K.pneumoniae的甘油代谢途径，其主要产物是1,3-丙二醇(1,3-PDO)，即使敲除了1,3-PDO合成的关键基因，仍然会有较高水平的副产物积累，D-乳酸的合成效率降低，对后期产品分离造成了不利影响。而且，工程菌在发酵过程中，为了维持相关蛋白的作用，需要加入昂贵的抗生素，增加了生产成本。

发明内容

为解决现有肺炎克雷伯氏菌的甘油代谢途径具有较高水平的副产物产物积累，降低了D-乳酸的合成效率，对后期产品分离造成了不利影响，并且发酵过程中需要加入昂贵的抗生素，生产成本高的问题，本发明提供了一种合成D-乳酸的重组菌及其构建方法与应用，本发明以Klebsiella pneumoniae ATCC25955为宿主菌株，通过构建基因缺失菌株，消除了乙酸、乙醇、2,3-丁二醇等副产物的合成，实现了葡萄糖到D-乳酸的高效转化，发酵过程不需要添加抗生素，生产成本、转化效率方面都具有一定优势。

本发明的第一个目的是提供一种利用葡萄糖合成D-乳酸的重组菌，所述重组菌是以肺炎克雷伯氏菌为出发菌株，将肺炎克雷伯氏菌基因组的乙酰乳酸合成酶基因budB、乙醇脱氢酶基因adhE和乙酸激酶基因ackA进行敲除得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述乙酰乳酸合成酶基因budB在NCBI的基因ID为11848061，所述乙醇脱氢酶基因adhE在NCBI的基因ID为11848216，所述乙酸激酶基因ackA在NCBI的基因ID为11848786。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是在肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae ATCC25955的基础上构建得到的。

本发明的第二个目的是提供一种所述重组菌的构建方法，具体步骤如下：

1)以肺炎克雷伯氏菌乙酰乳酸合成酶基因budB上下游500个碱基片段为模板设计引物，PCR扩增乙酰乳酸合成酶基因budB上下游片段，再利用回收试剂盒回收目的基因片段；

2)以步骤1)回收的基因片段为模板进行搭桥PCR，再利用回收试剂盒回收目的片段ΔbudB；