[发明专利]一种监控荧光定量PCR反应污染的方法

说明书

技术领域

本发明涉及荧光定量PCR反应的领域。具体地，本发明涉及一种监控荧光定量PCR反应污染的方法，本发明也涉及一种阳性对照质粒在监控荧光定量PCR反应污染中的应用。

背景技术

荧光定量PCR作为一种常用的技术手段，已经广泛应用到各种检测领域。但是在进行荧光定量PCR反应时，常常出现PCR污染，尤其是PCR气溶胶污染，并且往往难以判断污染源，给科研工作带来了相当大的困扰。

特别地，基于荧光定量PCR的基因分型是现代个体化用药常用的技术手段，与传染病病原体检测不同的是，病原体检测往往关注的是待检标本里面是否存在某种病原体以及存在数量的差异，而个体基因分型不同，待检标本里面已经非常明确基因组DNA的存在，检测结果不是这个基因型就是那个基因型的问题，即非“左”即“右”的问题，这种情况下，一旦出现扩增产物气溶胶污染往往很难鉴别，导致在检测结果上出现误判。而目前作为一种成熟的检测方法，往往需要设立比较好的阳性对照和阴性对照来确认检测结果的可靠性，基因分型方法目前常用的阳性对照包括基因组DNA和质粒，其中基因组DNA来源以及规模化生产比较困难，而质粒因为制备简单而广泛使用，但带来的问题是不可避免的出现气溶胶污染的问题。

综上所述，如何监控PCR气溶胶污染，特别地在基因分型方法中如何监控PCR气溶胶污染，是一个非常重要的环节。

发明内容

本发明的目的在于提供一种监控荧光定量PCR反应污染的方法，以及提供一种阳性对照质粒在监控荧光定量PCR反应污染中的应用，以准确地确定污染的来源。

为此，本发明提供了一种监控荧光定量PCR反应污染的方法，其包括下列步骤：

a.制备阳性对照质粒，该阳性对照质粒上包含待检目的基因和外参基因，该待检目的基因和外参基因不同源或同源性低至两者的相应引物不会错配；

b.制备PCR反应混合物，其包含：目的基因的引物和荧光探针；内参基因的引物和荧光探针；外参基因的引物和荧光探针；所述各个荧光探针具有不同的荧光基团；

c.在待检样品管的PCR反应混合物中加入待检样品DNA模板，在阳性对照管的PCR反应混合物中加入阳性对照质粒DNA模板，进行PCR扩增；

d.所有检测管中扩增的目的基因应全部为阳性，否则确定扩增失败；

e.待检样品管中扩增的内参基因应全部为阳性，否则确定扩增失败；

f.待检样品管中扩增的外参基因应全部为阴性，否则确定待检样品被阳性对照质粒气溶胶污染；

g.阳性对照管中扩增的内参基因应全部为阴性，否则确定被PCR产物气溶胶污染；

h.阳性对照管中扩增的外参基因应全部为阳性，否则确定扩增失败。

进一步地，本发明的监控荧光定量PCR反应污染的方法，还包括步骤i.在阴性对照管中加入PCR反应混合物和无菌纯净水，阴性对照管中扩增的全部基因应全部为阴性,如果阴性对照管中出现外参基因阳性信号，确定为阳性对照质粒气溶胶污染；在外参基因是阴性条件下其它通道出现阳性信号，则确定为PCR产物气溶胶污染。

进一步地，本发明提供了一种阳性对照质粒在监控荧光定量PCR反应污染中的应用，该阳性对照质粒包含待检目的基因和外参基因，该待检目的基因和外参基因不同源或同源性低至两者的相应引物不会错配。

优选地，本发明中待检目的基因是人源的，该外参基因是植物来源的，例如，玉米16S RNA基因。该待检目的基因是同一SNP位点的不同基因型，例如，人线粒体乙醛脱氢酶ALDH2基因。

本发明中所述的荧光探针可以是本领域可以商购合成的任何荧光探针，例如MGB探针、BHQ2、TaqMan、AllGlo和LNA荧光探针，并且不限于此。

本发明采用双参照质控体系，内参基因用于监测反应体系可能存在的抑制因素，包括PCR产物气溶胶污染，外参基因用于监控阳性对照质粒的气溶胶污染。

通过本发明的上述技术方案，可以得知每一个待检样品是否被阳性对照质粒污染，同时因为阳性对照质粒的对照孔没有内参品序列，因此通过对于阳性对照质粒样品的检测，可以判定是否被PCR产物气溶胶污染。

此方案与传统方案的优势在于，以往传统方案通过设立阴性对照孔监控污染，只能通过阴性对照孔是否出现信号判断是否出现污染，至于这种污染的来源是PCR产物气溶胶还是阳性对照质粒则无法判明，而本方案不仅可以区分是PCR产物气溶胶污染还是阳性对照质粒污染，而且如果是阳性对照质粒出现污染，还能判定具体是哪个样品出现污染，这种优势是通过传统的阴性对照方法无法实现的。