[发明专利]检测人外周血EVs‑TRPC5含量的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种检测TRPC5含量的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：包括MUC1包被的NHS磁珠、多孔包被板、缓冲液、TRPC5多肽标准品、TRPC5的抗体、铕标记的羊抗兔抗体、洗涤液及增强液。

2.一种利用权利要求1所述的试剂盒检测TRPC5含量的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)合成TRPC5多肽；

(2)用步骤(1)合成的所述TRPC5多肽作为包被原包被固相载体；

(3)用步骤(1)合成的所述TRPC5多肽通过偶联剂与KLH偶联得到免疫原；

(4)用步骤(3)得到的所述免疫原制备抗TRPC5的多克隆抗体；

(5)用促凝血清管采集新鲜血液，1000-2000r/min离心5-20min后收集上清液，用MUC1抗体包被的免疫磁珠与所述上清液混合后，经25-37℃震荡孵育0.5-2h或经2-8℃反应过夜，磁力架吸附磁珠，用缓冲液冲洗并重悬，得到待测样品；

(6)将步骤(5)所述待测样品进行竞争抑制检测分析，测量荧光强度，对照标准曲线计算样品中的TRPC5含量。

3.根据权利要求2所述的一种检测TRPC5含量的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：步骤(3)所述偶联剂为Sulfo-SMCC。

4.根据权利要求2所述的一种检测TRPC5含量的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：步骤(3)所述的免疫原免疫新西兰白兔，通过皮下多点注射制备抗体，使用抗原亲和柱进行纯化，获得步骤(4)所述的抗TRPC5的多克隆抗体。

5.根据权利要求2所述的一种检测TRPC5含量的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：步骤(2)所述固相载体为96孔微孔板。

6.根据权利要求2所述的一种检测TRPC5含量的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：步骤(5)所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

7.根据权利要求2所述的一种检测TRPC5含量的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：步骤(5)所述免疫磁珠为NHS磁珠。

8.根据权利要求7所述的一种检测TRPC5含量的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：所述NHS磁珠购自苏州Beaver公司。

9.根据权利要求2所述的一种检测TRPC5含量的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：步骤(6)所述标准曲线为步骤(1)合成的所述TRPC5多肽作为标准品，稀释成为0ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，40ng/mL，50ng/mL，80ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，400ng/mL，500ng/mL，800ng/mL，1000ng/mL系列浓度，稀释液为0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液，进行竞争抑制检测分析，将检测结果荧光值与标准品浓度取对数即log10，线性拟合，作为标准曲线。

10.根据权利要求2～9所述的一种检测TRPC5含量的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于，所述MUC1抗体包被的免疫磁珠制备方法为：

a.蛋白溶液配制：取50-100μg MUC1蛋白通过透析或者脱盐的方法彻底除去原有buffer里含伯胺基的物质，然后再用Coupling Buffer配成浓度为3.0-5.0mg/mL的蛋白溶液，将配制好的蛋白溶液于2-8℃保存备用；

b.取200-500μL 20％的磁珠悬浮液于EP管中；

c.将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液；

d.加1mL 2-8℃的Washing Buffer A于离心管中，涡旋15-30s，使磁珠混合均匀；

e.将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液；

f.加200-500μL蛋白溶液于EP管中，涡旋15-30s，使其混合均匀；

g.将EP管涡旋15-30s，置于垂直混合仪上，2-8℃反应过夜；

h.采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液；

i.加0.5-1mL Blocking Buffer于EP管中，涡旋15-30s，将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液；

j.加0.5-1mL Blocking Buffer于EP管中，涡旋15-30s，将EP管置于垂直混合仪中室温反应2-4h；

k.将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液；

l.加0.5-1mL超纯水于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液；

m.加0.5-1mL Storage Buffer于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液；重复该操作2次；

n.加入0.5-1mL Storage Buffer于EP管中，充分混合，2-8℃保存备用。