[发明专利]检测人外周血EVs‑TRPC5含量的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测人外周血EVs-TRPC5含量的试剂盒及方法。

背景技术

癌症(Cancer)，亦称恶性肿瘤(Malignant neoplasm)，为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。在各种疾病中，癌症可谓是“头号杀手”。世界卫生组织报告显示，2008年全世界约有1270万癌症新增患者，760万死于癌症，尤其在发展中国家，癌症新增例数达56％，据推测到2020年前，全球每年将新增1500万癌症患者。

乳腺癌是女性常见的癌症，严重威胁女性身心健康。中国抗癌协会公布的最新统计数字显示，从20世纪90年代以来，乳腺癌发病率和死亡率均持续稳定上升，发病率以每年4.476％的速度增长，死亡率以每年3％的速度增长。化学药物治疗是乳腺癌的主要治疗手段之一，目前临床常用药物有：(i)蒽环类，紫杉类，抗代谢类，抗微管类，烷化剂，杂类等；(ii)抗雌激素，芳香化酶抑制剂等；(iii)曲妥珠单抗(抗Her-2)、贝伐单抗(抗VEGF)。

但是，据美国癌症协会报道，90％以上肿瘤患者死于不同程度的化疗耐药。对化疗药物产生耐药已经成为肿瘤治疗的一大难题。经过近几十年的研究，目前发现的耐药机制有(1)细胞膜ABC药物转运蛋白表达增强，减少药物摄入及增加药物排出，P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是目前研究最多也是最为重要的ABC药物转运蛋白，由多药耐药基因mdr1编码；(2)通过使药物发生异化降低药物活性，常见的酶有GST、CYP450等；(3)药物作用靶点突变或表达水平变化等；(4)肿瘤异质性；(5)肿瘤干细胞耐药等。

目前，早期诊断肿瘤的最新、最有效的方法是通过验血寻找肿瘤标记物。肿瘤标志物指的是在肿瘤发生、发展的过程中，能反应细胞癌变的一些细胞内物质。临床上通过对各种肿瘤标志物的检测，可以对相应肿瘤做早期诊断、检测疗效和肿瘤复发状况。因此，在深入研究耐药机制的基础上，开发肿瘤耐药分子诊断指标、方法，实现试剂化，达到耐药早期、动态监测，在现阶段对于乳腺癌耐药的诊疗至关重要，也为优化药物结构设计、研发耐药逆转药物提供有益借鉴，因而具有重大而现实的社会价值。

MUC1是一种粘蛋白，在正常细胞表达时是一种跨膜糖蛋白，正常情况下，在乳腺、胃肠道及泌尿生殖道的上皮细胞顶端表达，糖基化完全。MUC1度正常上皮起润滑和保护作用、介导信号转导和细胞黏附。

在乳腺癌细胞株MCF-7中通过磷酸化，MUC1能结合Rrb/SOS，参与受体酪氨酸激酶介导的信号转导，而酪氨酸磷酸化是膜受体参与信号转导的一个关键步骤。乳腺癌MUC1的表达特点包括：高表达、异常表达低；糖基化、高唾液酸化；顶端定为不清，极性混乱；细胞浆和细胞表面都有过度表达，并且这些分子会从乳腺癌细胞进入血清。有研究者检测基底样乳腺癌患者，发现高表达MUC1，大约有92％的患者能检测出过表达的MUC1。

免疫磁珠，也称免疫磁性微球，是一种均匀、具有超顺磁性及保护性壳的球形小粒子，基本上由载体微球和免疫配基结合而成。其核心为顺磁性粒子，核心外层包裹聚合物，最外层是免疫配基。免疫磁珠技术，是一种以特异的抗原抗体反应为基础的免疫学检测和分离技术。它是以抗体包被的磁珠为载体，通过抗体与反应介质中特异性抗原结合，形成抗原—抗体复合物，此复合物在外加磁场的作用下发生定向移动，从而达到分离抗原的目的。

TRPC5是瞬时受体电位通道(transient receptor potential channels，TRP通道)家族的一个亚型，它是细胞膜上能通透钙离子的非选择性通道，主要分布于脑、肺、睾丸和胎盘，并主要参与生长锥的形成和脑的发育。本研究室研究发现，瞬时受体电位通道TRPC5与肿瘤多药耐药密切相关，TRPC5在耐阿霉素的乳腺癌细胞(MCF-7/ADM)中发生明显上调，并能间接介导肿瘤产生多药耐药的P-gp蛋白在多药耐药肿瘤细胞(如MCF-7/ADM)中的表达水平。本申请人针对该性质申请了相关专利，专利名称为《TRPC5作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用》(专利号：201210318389.5)《EVs-TRPC5在检测乳腺癌耐药程度中的应用》(授权公告号：CN103954770B)。

时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)由于其特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前还没有针对TRPC5检测的时间荧光免疫分析法的专利和文献报道。