[发明专利]一种同型半胱氨酸自动化检测试剂、制备方法及检测方法

权利要求书

1.一种同型半胱氨酸自动化检测试剂，含有抗S-腺苷同型半胱氨酸特异性抗体和酶试剂，其特征在于：所述的酶试剂由S-腺苷同型半胱氨酸酶标偶联物和酶的底物组成，酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，酶的底物为葡萄糖-6-磷酸；

所述的抗S-腺苷同型半胱氨酸特异性抗体由S-腺苷同型半胱氨酸免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与S-腺苷同型半胱氨酸特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物；

所述的S-腺苷同型半胱氨酸免疫原，其结构式如式(Ⅰ)所示：

载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽。

2.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸自动化检测试剂，其特征在于：所述的完整的抗体分子、抗体片段或抗体衍生物，为采用单一的S-腺苷同型半胱氨酸免疫原对实验动物加强免疫所获得的多克隆抗体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述的实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马的一种。

3.一种如权利要求1所述的同型半胱氨酸自动化检测试剂的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：

(1)试剂A：将2.018～8.072g、5.625～22.50mM氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和0.856～3.422g、5.625～22.50mM葡萄糖-6-磷酸用0.5～2L 55mM、pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将抗S-腺苷同型半胱氨酸特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗S-腺苷同型半胱氨酸特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:250～1:7500；

(2)试剂B：将S-腺苷同型半胱氨酸酶标偶联物加到120mM、pH＝8.2的Tris缓冲液中，S-腺苷同型半胱氨酸酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:250～1:7500；

其中，S-腺苷同型半胱氨酸酶标偶联物的制备方法包含以下步骤：

(1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：称取7.5～22.5mg规格为100KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温溶解于6～18mL含有72.6mg 0.05M Tris、8mg 3.3mM MgCl₂和100mg NaCl的溶液中，pH＝8.5～9.0；在溶液中加入112.5～337.5mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、67.5～202.5mg葡萄糖-6-磷酸以及0.375～1.125mL卡必醇、0.375～1.125mL三乙胺；加热到30-35摄氏度，再一次性加入1～3mL二甲基亚砜，摇匀后静置5-15s；

(2)S-腺苷同型半胱氨酸的激活：在无水状态下称取5～15mg S-腺苷同型半胱氨酸，溶解于300～900μL二甲基甲酰胺中；使上述溶液温度降到-10～-20℃；加入1.5～4.5μL三丁胺，加入1.5～4.5μL N-甲基吗啉并在-10～-20℃搅拌15～30分钟；加入0.75～2.25μL氯甲酸异丁酯；加入0.1～2μL碳二亚胺EDC；5～15mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺；0.1～2μL甲醇；5～15mg BSA；-10～-20℃搅拌30～60分钟；

(3)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与S-腺苷同型半胱氨酸的连接：将步骤(2)激活的S-腺苷同型半胱氨酸溶液逐滴加入到步骤(1)溶解的温度为30-35摄氏度的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2-8℃搅拌过夜；

(4)纯化产物。

4.一种如权利要求3所述的同型半胱氨酸自动化检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，S-腺苷同型半胱氨酸的激活：在无水状态下称取5～15mg S-腺苷同型半胱氨酸，溶解于300～900μL二甲基甲酰胺中；使上述溶液温度降到-15～-20℃；加入1.5～4.5μL三丁胺，加入1.5～4.5μL N-甲基吗啉并在-15～-20℃搅拌15～30分钟；加入0.75～2.25μL氯甲酸异丁酯；加入0.1～2μL碳二亚胺EDC；5～15mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺；0.1～2μL甲醇；5～15mg BSA；-15～-20℃搅拌30～60分钟。