[发明专利]一种同型半胱氨酸自动化检测试剂、制备方法及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测试剂领域，具体涉及一种同型半胱氨酸自动化检测试剂、制备方法及检测方法。

背景技术

同型半胱氨酸(Homocysteine，HCY)，其结构式如式(Ⅱ)所示：

同型半胱氨酸又称高半胱氨酸，是由细胞内的甲硫氨酸去甲基后形成的一种硫醇氨基酸。同型半胱氨酸与心血管疾病密切相关，它是评估心血管疾病发生过程中的一个重要的风险因子，血液中升高的同型半胱氨酸会刺激血管壁引起动脉血管损伤，导致炎症和管壁的斑块形成，最终引起心脏血流受阻。同型半胱氨酸检测在临床上已有多年应用史，其安全性及可靠性已得到验证。另有研究表明，同型半胱氨酸可作为神经管畸形、先兆子痫、帕金森氏病、老年痴呆、胎儿生长迟缓、动脉粥样硬化、慢性肾功能不全、牛皮癣、维生素B₁₂缺乏、叶酸缺乏等多种疾病的临床辅助诊断依据，其临床意义极为重要。

目前，临床上测定血清或血浆中同型半胱氨酸的方法较多，但现有方法都较为费时费力，且检测成本较高，不适合大批量临床样品的测定。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的同型半胱氨酸检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂。因此，研发生产质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的同型半胱氨酸测定试剂盒已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对同型半胱氨酸的高通量、快速化检测，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，能有效满足国内日益增长的临床检测需求。

发明内容

本发明为了克服现有技术存在的缺陷，采用独特的S-腺苷同型半胱氨酸制备免疫原性强的S-腺苷同型半胱氨酸免疫原及其抗体，用该抗体制备的同型半胱氨酸均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对同型半胱氨酸高通量、快速化的检测。该检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低同型半胱氨酸检测成本，有利于临床推广使用。

本发明的一个目的在于提供一种同型半胱氨酸均相酶免疫检测试剂，含有抗S-腺苷同型半胱氨酸特异性抗体和酶试剂，其特征在于：所述的酶试剂由S-腺苷同型半胱氨酸酶标偶联物和酶的底物组成，酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，酶的底物为葡萄糖-6-磷酸；

所述的抗S-腺苷同型半胱氨酸特异性抗体由S-腺苷同型半胱氨酸免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与S-腺苷同型半胱氨酸特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物；

所述的S-腺苷同型半胱氨酸免疫原，其结构式如式(Ⅰ)所示：

载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽。优选为血清蛋白、血蓝蛋白和甲状腺球蛋白，更优选为血清白蛋白，进一步优选为牛血清白蛋白。

所述的S-腺苷同型半胱氨酸免疫原由S-腺苷同型半胱氨酸与上述载体连接而成，S-腺苷同型半胱氨酸的化学结构如式(Ⅲ)所示：

所述的S-腺苷同型半胱氨酸免疫原的制备步骤如下：

(1)将载体蛋白100～300g溶解于25～75mL 0.2M，pH 8.5的磷酸缓冲液中；

(2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：100～300mg S-腺苷同型半胱氨酸、1.75～5.25mL二甲基甲酰胺、1.5-2.5mL二氧六环、15-25mg琥珀酸酐、1.75～5.25mL乙醇、3.5～10.5mL 10mM，pH 5.0的磷酸钾缓冲液、100～300mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺，将上述化学品在室温下搅拌溶解反应30～60min，以上操作在暗处进行；

(3)将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到S-腺苷同型半胱氨酸免疫原。

一种抗S-腺苷同型半胱氨酸特异性抗体，由上述的S-腺苷同型半胱氨酸免疫原免疫实验动物后生产得到。

所述的抗S-腺苷同型半胱氨酸特异性抗体由上述制得的S-腺苷同型半胱氨酸免疫原采用常规方法接种实验动物，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：

(1)用PBS将上述合成的BSA-S-腺苷同型半胱氨酸免疫原稀释至0.1～3.0mg/mL，得到抗原溶液，然后用0.5～5.0mL抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；

(2)2～3周后，再用0.5～5.0mL相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射3～6次；