[发明专利]一种狂犬病疫苗的生产方法

说明书

本发明公开了一种狂犬病疫苗的生产方法，该方法包括如下步骤：(1)狂犬病毒培养，制备病毒收获液；(2)病毒纯化，制备疫苗原液；(3)将疫苗原液与辅料混合，制备成疫苗；其中，步骤(2)之前或之后进行病毒灭活；步骤(2)的病毒纯化包括次序可互换的阴离子交换层析和羟基磷灰石层析。本发明的狂犬病毒生产方法显著提高了纯化后原液抗原纯度，纯度达到重组DNA技术治疗类生物制品标准(95％以上)；进一步降低了杂质残留量，特别是HCP的残留量，限量标准明显高于现行版国家药典同类制品；进一步提高了有效成分的免疫原性，在NIH效价更高的前提下，每剂疫苗所含原液蛋白质含量明显低于现行版国家药典同类制品限量。

技术领域

本发明属于疫苗生物学技术领域，具体涉及一种狂犬病疫苗的生产方法。

背景技术

狂犬病是一种高度致命的疾病。由于缺乏有效的治疗手段，人暴露于病毒后一旦进入发病阶段，死亡几乎不可避免。疫苗免疫接种是控制人患狂犬病发生和流行的唯一有效手段。狂犬病疫苗研发、生产和使用130年的实践证明，通过生产方法的持续创新使人用狂犬病疫苗的质量不断得到改进，对于提高疫苗保护效果、挽救更多暴露后人群的生命并降低疫苗使用者的不良反应发生率具有重要意义。

现有的人用狂犬病疫苗生产方法中，纯化工艺主要是利用分子量大小差异或浮力密度差异将病毒收获液中的有效成分与杂质进行分离，分离原理都属于分子筛性质。早期制品采用微孔滤膜过滤技术（微滤）去除组织碎片、脱落细胞或细胞碎片。其后，为提高疫苗效价，增加了超滤浓缩技术，一些小分子杂质也在超滤过程中被去除。1970s建立的蔗糖区带超速离心纯化工艺和1990s建立的凝胶过滤柱层析纯化技术，进一步提高了制品的纯度。此后，人用狂犬病疫苗制品纯化工艺不再有大的改进。国内外各种类型的狂犬病疫苗制品纯化工艺大致相同：病毒收获液微滤澄清、超滤浓缩、蔗糖区带超速离心或凝胶过滤柱层析。

由于现有的狂犬病毒疫苗纯化工艺所存在的不足，导致现有的人用狂犬病疫苗还存在一些问题。主要问题包括：

（1）纯度偏低。由于纯化工艺的原因，疫苗制品中有害杂质残留量偏高，导致疫苗使用者产生不良反应。这些有害杂质包括来源于宿主细胞的蛋白质和DNA、来源于工艺过程添加的牛血清蛋白质及来源于病毒灭活过程中形成的β-丙内脂-人血白蛋白复合物等。

（2）有效成分剂量可控性差。由于杂质含量高，无法采用快速准确的理化分析方法对有效成分的剂量进行检测和控制，只能依靠NIH效价测试法或酶联免疫抗原测试法。二种方法测试结果都不准确，前者测试结果偏差范围大（根据世界卫生组织专家委员会公布的数据，NIH效价测试结果偏差范围为25%～400%）；后者测试结果为有效成分和产品相关杂质（结构异常、免疫原性低的病毒）的总量，与生物学效价相关性差。有效成分剂量不能准确控制，则有可能出现剂量偏低导致免疫失败；或可能出现剂量偏高导致不良反应发生率提高。

（3）制剂复杂且稳定性差。由于纯度低，制剂中需要添加大量的保护剂才能保持制品生物学活性的稳定性。辅料过多不仅增加使用者的体内代谢负担，也增加了产品生产成本。

上述问题主要源于制品生产方法，特别是病毒纯化方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种狂犬病疫苗的生产方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种狂犬病疫苗的生产方法，包括如下步骤：

（1）狂犬病毒培养，制备病毒收获液；

（2）病毒纯化，制备疫苗原液；

（3）将疫苗原液与辅料混合，制备成疫苗；

在步骤（2）之前或之后进行病毒灭活，优选在病毒纯化之后进行病毒灭活；