[发明专利]一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法

权利要求书

1.一种用于环介导等温扩增的数字miRNA分析方法的乳液，其特征在于：包括水相和油相：

所述水相由生物素标记的引物与亲和素标记的磁珠复合物、目标miRNA介导的连接DNA模板、荧光标记的引物、反应缓冲溶液、Bst聚合酶按体积比(3～6)：(0.5～2)：(2～6)：(8～13)：(3～8)混合均匀；

所述油相由DC5225C、DC749、Ar20按质量比(3～5)：(2～4)：(2～4)混合均匀；

将所述水相和油相按体积比1:2～1:3加入反应管中研磨，得到稳定乳液。

2.如权利要求1所述的乳液在环介导等温扩增的数字miRNA分析方法中的应用。

3.一种利用如权利要求1所述的乳液进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)制备引物标记的磁珠；

(2)以目标miRNA为模板设计两条DNA发夹探针H1和H2；

(3)在目标存在的情况下，目标miRNA与H1和H2退火杂交，用连接酶将H1和H2连接形成双哑铃DNA结构；

(4)配制乳液；

(5)将反应管放入恒温水浴槽中，在55℃～65℃下反应4～6小时，得到磁性颗粒-环介导等温扩增产物-荧光标记引物的复合物；

(6)在反应管中加入1毫升异丙醇，破乳洗涤两次，离心后弃去上清收集磁珠；

(7)将步骤(4)得到的磁珠进行显微镜检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数；

(8)将步骤(4)得到的磁珠进行流式检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数。

4.根据权利要求3所述的一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法，其特征在于：步骤(1)所述制备引物标记的磁珠是通过如下步骤制备的：

在离心管中用TES缓冲液洗涤链霉亲和素包被的直径为0.5～2μm的磁珠，洗涤两次后，向磁珠中加入7～15μM生物素标记的引物，室温下孵育15～30分钟，得到制备生物素标记的引物与亲和素标记的磁珠复合物；

5.根据权利要求1所述的一种用于环介导等温扩增的数字miRNA分析方法的乳液，其特征在于：所述水相由生物素标记的引物与亲和素标记的磁珠复合物、目标miRNA介导的连接DNA模板、荧光标记的引物、反应缓冲溶液、Bst聚合酶按体积比3：1：4：10：6混合均匀。