[发明专利]一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其是涉及一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法。

背景技术

乳液PCR的原理简单来说是通过单链DNA模板与捕获磁珠结合后，PCR反应试剂与油相混合形成乳液，得到一系列皮升大小的小液滴-小而独立的反应室。在这个微小的反应室中进行扩增反应，扩增后的产物富集在磁珠上，通过离心和磁分离收集磁珠，洗脱后对磁珠上的PCR产物进行测序。该技术可将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应，最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。

然而，目前数字PCR技术的由于PCR反应在乳液中的扩增效率不高，导致磁珠捕获扩增产物进行荧光标记后信号放大效果有限，通常需要对信号进行二次放大等步骤，需要使用更为精密的仪器以及较昂贵的控温设备，这在一定程度上制约了其在核酸数字定量上的发展。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明旨在提出一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法，该方法较于乳液PCR有更高的核酸扩增效率和信号放大效果，而且本发明待测的miRNA样本无需预先进行PCR扩增，在扩增反应后直接破乳即可上样分析。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种用于环介导等温扩增的数字miRNA分析方法的乳液，包括水相和油相：

所述水相由生物素标记的引物与亲和素标记的磁珠复合物、目标miRNA介导的连接DNA模板、荧光标记的引物、反应缓冲溶液、Bst聚合酶按体积比(3～6)：(0.5～2)：(2～6)：(8～13)：(3～8)混合均匀；

所述油相由DC5225C、DC749、Ar20按质量比(3～5)：(2～4)：(2～4)混合均匀；

将所述水相和油相按体积比1:2～1:3加入反应管中研磨，得到稳定乳液。

进一步的，乳液在环介导等温扩增的数字miRNA分析方法中的应用。

进一步的，所述的乳液进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法包括如下步骤：

(1)制备引物标记的磁珠；

(2)以目标miRNA为模板设计两条DNA发夹探针H1和H2；

(3)在目标存在的情况下，目标miRNA与H1和H2退火杂交，用连接酶将H1和H2连接形成双哑铃DNA结构；

(4)配制乳液；

(5)将反应管放入恒温水浴槽中，在55℃～65℃下反应4～6小时，得到磁性颗粒-环介导等温扩增产物-荧光标记引物的复合物；

(6)在反应管中加入1毫升异丙醇，破乳洗涤两次，离心后弃去上清收集磁珠；

(7)将步骤(4)得到的磁珠进行显微镜检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数；

(8)将步骤(4)得到的磁珠进行流式检测，对产生荧光信号的磁珠进行计数。

进一步的，步骤(1)所述制备引物标记的磁珠是通过如下步骤制备的：

在离心管中用TES缓冲液洗涤链霉亲和素包被的直径为0.5～2μm的磁珠，洗涤两次后，向磁珠中加入7～15μM生物素标记的引物，室温下孵育15～30分钟，得到制备生物素标记的引物与亲和素标记的磁珠复合物；

进一步的，所述水相由生物素标记的引物与亲和素标记的磁珠复合物、目标miRNA介导的连接DNA模板、荧光标记的引物、反应缓冲溶液、Bst聚合酶按体积比3：1：4：10：6混合均匀。

相对于现有技术，本发明所述的一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法具有以下优势：

(1)本发明所述的一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法，该方法较于乳液PCR有更高的miRNA扩增效率和信号放大效果，而且miRNA样本无需预先进行PCR扩增，并在扩增反应后直接破乳即可上样分析。

(2)本发明所述的一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法，此方法对目标序列没有依赖性，只要进行配套的引物设计即可开展目标miRNA的数字分析

(3)本发明所述的一种乳液中进行环介导等温扩增的数字miRNA分析方法，该方法不需要复杂的芯片、温控设备等成本较高的设备即可完成对miRNA的数字分析，简化了实验步骤，利用环介导等温扩增的优势缩短了时间、提高了效率，为基因诊断和基因治疗等研究提供了一种工艺简单、信号稳定、具有较高的灵敏度与准确性的数字miRNA分析手段。

附图说明