[发明专利]一种基于抗原蛋白多聚体的结核分枝杆菌亚单位疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种基于八臂聚乙二醇修饰结核分枝杆菌抗原蛋白，形成抗原蛋白多聚体，从而作为一种结核分枝杆菌亚单位疫苗。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染引起的一种慢性传染病，是当今严重危害人类健康的公共卫生问题之一。据2014年世界卫生组织报告，估计全球有960万新的活动性结核病例和150万死亡病例，约三分之一的世界人口感染了结核分枝杆菌。中国一直是世界上结核病疫情较严重的国家，同时也是全球20多个结核病高负担国家之一。

卡介苗(BCG)是全球控制结核病疫情最常用的疫苗。通常在婴儿出生后不久给予接种卡介苗。卡介苗能有效地控制粟粒性结核病在婴幼儿中的发展，但对成年人的活动性肺结核不起作用，并且卡介苗无法控制潜伏性肺结核的再活化作用。此外，卡介苗在近几年的临床应用中效果不甚理想，总体的有效防控率不超过50％，而且在不同国家和不同地区的接种效果也不尽相同。目前，越来越多的国家面临多重耐药菌株的感染、HIV合并感染等诸多问题，这使得结核病的防控更加棘手，迫切需要开发更加安全有效的疫苗。蛋白质亚单位疫苗是一种新型、安全、经济的疫苗，但其存在免疫原性弱的缺点。因此，需要通过提高抗原蛋白的免疫原性来提高蛋白质亚单位疫苗的免疫保护效果，同时免疫佐剂递送系统也可提高抗原蛋白诱导产生保护性免疫应答的能力。

目前，已经有多种基于结核分枝杆菌抗原蛋白的亚单位疫苗进入临床试验阶段。TB10.4和CFP10属于结核分枝杆菌早期分泌的抗原蛋白，是结核分枝杆菌重要的抗原蛋白。本发明所用的CFP10-TB10.4融合蛋白(CT)是将TB10.4和CFP10融合表达得到，其分子量为25kDa。CT仍属于低分子量的抗原蛋白，具有较低的免疫原性。通常认为在抗原蛋白多聚体化与其免疫原性增强之间存在潜在的联系。有一种解释是抗原蛋白多聚体化使得其抗原决定簇的重复结构增多，增强了免疫系统吞噬、摄取、识别、提呈和加工的能力。

铝盐佐剂在20世纪20年代被首次用作免疫佐剂使用，并且是至今应用最为广泛的一类疫苗佐剂。铝盐佐剂可通过激活Th2型细胞分泌IL-4，诱发以体液免疫为主的免疫应答，尤其是IgG1和IgE抗体应答，并可以与其它佐剂或疫苗递送系统相容。洛索立宾(loxoribine,7-allyl-7,8-dihydro-8-oxo-guanosine)是一种人工合成的鸟苷类似物，可以作为免疫调节剂使用。此外，洛索立宾作为TLR7激动剂，可以与TLR7结合，进而激活MyD88依赖性的TLR/IL-1R信号通路，促进CD4⁺T细胞的增殖和细胞因子的分泌。聚肌胞苷酸(polyinsinicpolycytidylic acid,poly(I:C))是一种人工合成的双链RNA，可作为病原体相关的分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)与机体的TLR3结合，产生类似病毒感染的免疫反应，是一种高效的干扰素诱生剂。研究表明，poly(I:C)作为免疫佐剂，可提高蛋白类疫苗的体液免疫应答和细胞免疫应答。Poly(I:C)还可以增强局部引流淋巴结中树突状细胞的比例，诱导树突状细胞的稳定与成熟，增加活化的抗原特异性CD4⁺T细胞增殖和存活，并增强抗原特异性CD8⁺T细胞的数量及其在体内的存活。

发明内容

1.本发明通过化学修饰的方法，将八臂聚乙二醇与CFP10-TB10.4融合蛋白(CT)偶联形成CT抗原蛋白多聚体(CT-PEG)，并加入免疫佐剂制备出了一种新型结核分枝杆菌亚单位疫苗，能够诱导机体产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答。八臂聚乙二醇有八个分枝末端，每个末端带有一个琥珀酰亚胺酯基团。

2.本发明涉及多聚体蛋白的制备工艺，包括以下步骤：

(1)将八臂聚乙二醇溶于20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，加入溶于20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的CT，于4℃下反应12小时。

(2)CT-PEG的纯化方法采用半制备型凝胶过滤柱Superdex 200凝胶过滤柱(2.6厘米×60厘米)，洗脱液为含有0.15M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)，流速为3毫升/分钟。收集CT-PEG对应的洗脱峰。

3.本发明涉及一种结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备工艺，包括以下步骤：