[发明专利]一种快速检测富贵竹炭疽病病原菌的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种特异性引物的快速检测病原物的方法，具体涉及一种快速检测富贵竹炭疽病病原菌的方法及其应用。

背景技术

富贵竹炭疽病病原菌（龙血树炭疽菌）为半知菌类、炭疽菌属、龙血树炭疽菌Colletotrichum dracaenhophilum D.F. Farr & M.E. Palm。在寄主上，分生孢子盘埋生于表皮下，圆形或椭圆形，突破表皮后，形成黄色分生孢子堆，有刚毛，2-4个细胞，褐色至淡褐色，基部至顶端渐细，118-165µm×3.5-7.3µm，分生孢子梗淡褐色至无色,圆柱状，1-3个细胞，表面光滑，43-55×4.5-7.3µm，平均：47×5.5µm。分生孢子单孢，光滑，无色，两端钝圆，圆柱状或棍棒状，偶有弯曲，19.8-30.6 ×5.3-7.3µm，平均：25.1 ×6.1µm。

在PDA培养基上，生长速度快，菌落直径10天达85mm ，菌落白色至淡粉色，边缘整齐，未见菌核。刚毛淡褐色至深褐色。分生孢子梗淡褐色至无色,圆柱状，1-3个细胞，表面光滑。分生孢子单孢，无色，光滑，两端钝圆，圆柱状或棍棒状，偶有弯曲，20-31×6.2-9.4µm。分生孢子附着孢，单孢，浅褐色至深褐色，圆形或椭圆形，边缘完整，11.7-19×8.2-14.4µm，平均：14.6×10.6µm。

该病原菌能够引起富贵竹炭疽病，是广泛发生于富贵竹产区的一种较为严重的叶部及茎部病害。富贵竹炭疽病在世界各国富贵竹产区都有发生，成为富贵竹上主要病害之一，每年都会造成一定的产量损失，严重影响其观赏价值。因此，尽早快速的检测该病原菌对减轻该病害造成的损失具有重要的意义。传统上该病菌的分类和鉴定主要基于形态学特征、致病性测定等 。传统的病菌鉴别方法耗时长、灵敏度低以及经验性强，发病植株中分离并鉴定病原菌需要数天时间，难以做到对病害发生的及时监测和有效控制病原菌的传播与病害流行。随着分子生物学的发展，不同分子技术应用于植物病原真菌病害的检测。

发明内容

本发明为解决富贵竹炭疽病快速鉴定、准确监测该病原菌潜伏侵染与否的技术问题，公开了一种快速检测富贵竹炭疽病病原菌的方法及其应用。

为解决上述技术问题，采用以下技术方案：

一种快速检测富贵竹炭疽病病原菌的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的总DNA；

（2）以总DNA为模板，以特异性引物ZM3-7F、特异性引物ZM3-7R为引物，对目的片段进行PCR扩增；

（3）将步骤（2）的扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶中电泳检测，并分析结果；

所述特异性引物ZM3-7F序列如SEQ ID NO：1所示，特异性引物ZM3-7R序列如SEQ ID NO：2所示。

所述步骤（2）中总DNA的最低检测浓度为10pg/μL；目的片段大小为468bp。

所述步骤（2）中PCR反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL，0.625U Taq 酶，dNTP Mixture 0.4mM，Mg²⁺ 3mM，5μmol的特异性引物ZM3-7F和5μmol的特异性引物各1μL，DNA模板1μL，ddH₂O补至25μL。

所述步骤（2）中PCR反应程序为：95℃预变性3min，94℃变性45s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。

所述快速检测富贵竹炭疽病病原菌的方法作为及时快速检测富贵竹炭疽病病原菌、减轻病害损失的应用。

本发明的有益效果在于：本发明通过比对所测序的富贵竹炭疽病与GenBank 中炭疽病属中其它近似种的ITS基因的部分序列，利用Primer6.0软件分析，设计出了可用于检测富贵竹炭疽病病原菌（龙血树炭疽菌）的特异性引物，为富贵竹炭疽病快速鉴定、准确监测该病原菌潜伏侵染与否奠定了基础，有利于及早有效的采取防治措施。

附图说明