[发明专利]转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法

权利要求书

1.一种转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备龙葵外植体；

(2)制备转gshB基因侵染菌液：将gshB基因与真核表达载体PBI121-gfp连接，将连接产物用热激法转化发根农杆菌A4感受态细胞；涂平板，挑取阳性克隆，转入含有卡那抗性的YMA液体培养基扩增培养，得到转gshB基因侵染菌液；

(3)共培养诱导转gshB基因龙葵毛状根：将转gshB基因侵染菌液与龙葵外植体进行共培养；

(4)除菌培养：将共培养后的龙葵外植体转移到已湿润的滤纸上于28℃弱散射光培养2d，随后转入含有500mg/L的头孢噻肟钠的MS培养基上进行除菌培养，一周后转到不含头孢噻肟钠的MS固体培养基上，一个月后龙葵外植体愈伤处会长出的细长毛状根；

(5)毛状根液体培养基的扩大培养：将毛状根转入MS液体培养基中，扩大培养；

(6)转gshB基因龙葵毛状根的检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述扩增培养是在28℃，150-200rpm摇床中扩增至OD₆₀₀＝0.6。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(6)所述转gshB基因龙葵毛状根的检测可以采用分子鉴定和荧光检测的方法。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述分子鉴定是通过提取毛状根的DNA，PCR法检测农杆菌Ri质粒中的rolB基因和PBI121-gshB-gfp融合基因，判断是否成功获得转gshB基因毛状根；所述荧光检测是通过绿色荧光蛋白检测，验证是否成功获得转gshB基因毛状根。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述荧光检测的荧光显微镜的参数是波长487nm、曝光时间583ms。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述龙葵外植体是通过取龙葵种子灭菌后接种于MS固体培养基，28℃光照培养，当龙葵无菌苗长出3到4对真叶后，剪取无菌叶片获得。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)所述扩大培养为28℃，100-110rpm摇床进行培养。