[发明专利]转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域。更具体地，涉及一种转gshB基因提高龙葵毛状根镉富集的方法。

背景技术

龙葵是茄属茄科一年生草本植物，几乎全中国都有分布，广泛分布于亚、欧、美洲的温带至热带地区。目前，世界范围内已经发现的重金属超富集植物有400多种，在已发现的超富集植物中，Cd超富集植物总体上很少，目前仅报道遏蓝菜(Thlaspi arvense L)、宝山堇菜(Viola baoshanensis)、油菜(Brassicacampestris L.)、东南景天(Sedum alfredii)、龙葵(Solanum nigrum L.)、商陆(Phytolacca acinosa Roxb)、红菾菜(Beta vulgarisvar.cicla)等Cd超富集植物。在这些植物中，遏蓝菜是研究最多的，但遏蓝菜对Cd的富集不具备特异性。龙葵因其分布广泛、生命力强、对Cd的富集更专一等优势得到越来越多的关注。

随着工农业的迅速发展和城市人口的剧增，环境污染问题与日剧增，环境问题越来越受到人们的重视，污染环境的修复方法也成为全球关注的热点。在各种各样的环境污染治理技术中，生物修复以其处理费用低、操作简单、处理效果好、不易造成二次污染等特点而受到越来越多的关注。生物修复至今仅有30多年的研究历史，但是20世纪80年代以后，一些生物修复技术已经开始在污染环境治理中推广应用并取得了良好的效果。转基因植物由于具有更好的耐受力和积累量，可以得到更好的土壤修复效果。近年来，利用转基因植物修复污染土壤的生物修复技术已经成为研究的热点(张玉秀,柴团耀,G.rard Burkard.植物耐重金属机理研究进展[J].植物学报,1999,41(5):453-457.)。

通过转基因技术获得Cd超富集植物龙葵毛状根株系，不仅在研究龙葵富集重金属Cd代谢途径和分子调控机制方面具有重要的理论意义，并且在将来大规模种植龙葵富集土壤中重金属Cd方面具有重要的应用前景和价值。尽管目前已有利用毛状根为材料开展对重金属富集的相关研究，但并无将gshB基因转入发根农杆菌，诱导出能超富集Cd的转gshB基因龙葵毛状根的研究。

因此，需要提供一种通过转gshB基因提高龙葵毛状根的Cd富集能力的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过转gshB基因实现植物龙葵的毛状根Cd超富集的方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明一种转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法，包括以下步骤：

(1)制备龙葵外植体；

(2)制备转gshB基因侵染菌液：将gshB基因与真核表达载体PBI121-gfp连接，将连接产物用热激法转化发根农杆菌A4感受态细胞；涂平板，挑取阳性克隆，用YMA液体培养基扩增培养，得到转gshB基因侵染菌液；

(3)共培养诱导转gshB基因龙葵毛状根：将转gshB基因侵染菌液与龙葵无菌叶片进行共培养；

(4)除菌培养：将共培养后的龙葵叶片转移到已湿润的滤纸上于28℃弱散射光培养2d，随后转入含有500mg/L的头孢噻肟钠的MS培养基上进行除菌培养，一周后转到不含头孢噻肟钠的MS固体培养基上，一个月后龙葵叶片愈伤处会长出的细长毛状根；

(5)毛状根液体培养基的扩大培养：将固体培养基中的毛状根转入MS液体培养基中扩大培养；

(6)转gshB基因龙葵毛状根的检测：所述检测包括分子鉴定和荧光检测；其中，所述分子鉴定是通过提取毛状根的DNA，PCR法检测农杆菌Ri质粒中的rolB基因和PBI121-gshB-gfp融合基因，判断是否成功获得转gshB基因毛状根；所述荧光检测是通过绿色荧光蛋白检测，验证是否成功获得转gshB基因毛状根。

进一步，步骤(1)所述龙葵外植体是取龙葵种子灭菌后接种于MS固体培养基，28℃光照培养，当龙葵无菌苗长出3到4对真叶后，剪取无菌叶片作为诱导毛状根的龙葵外植体；

进一步，步骤(2)中所述扩增培养是在28℃，150-200rpm摇床中扩增至OD₆₀₀＝0.6。

进一步，步骤(5)中所述扩大培养为28℃，100-110rpm摇床进行培养。

进一步，步骤(6)中所述荧光检测的荧光显微镜的参数是波长487nm、曝光时间583ms。