[发明专利]一种利用两步酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法

权利要求书

1.一种利用两步酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：

A.酶解缓冲液的配制

准确配制0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L的柠檬酸溶液，将两种溶液按照1.06:1的体积比混合，并用盐酸调节混合溶液的pH至5.0；

B.第一步酶解

向步骤A中配制好的酶解缓冲体系中加入底物黄芪甲苷，底物中黄芪甲苷的质量百分比为10％，体系中黄芪甲苷的质量浓度为0.1g/L～1g/L；待底物完全溶解后加入水解酶1，水解酶1和黄芪甲苷的质量比为5:1；调节反应体系的pH为4.6～5.2，最后将反应体系置于温度45～55℃和搅拌转速为200r/min的条件下充分反应48～72h；

C.第二步酶解

用盐酸调节步骤B中反应结束后的体系pH至7.0～7.6，再向该体系中加入水解酶2，水解酶2和黄芪甲苷的质量比为50:1，最后将反应体系置于温度为25～35℃和搅拌转速为200r/min的条件下充分反应48～72h；

D.环黄芪醇的分离纯化

将步骤C中含有产物环黄芪醇的水解液经水饱和正丁醇萃取后真空浓缩蒸干得到萃取产品，并进一步利用硅胶柱层析分离纯化，最终再通过乙醇重结晶将产品的纯度提高到95％以上，得到环黄芪醇产品；

步骤B中所用的水解酶1为纤维素酶，水解断裂的是黄芪甲苷C₃位置的β-木糖糖苷键；

步骤B中得到酶解产物是6-O-葡萄糖-环黄芪醇；

步骤C中水解酶2为来源于Phycicoccus sp.Soil748的β-葡萄糖苷酶，其基因长度为1848bp，编码616个氨基酸，具体基因序列为SEQ ID No.1，编码的蛋白质序列为SEQ IDNo.2，水解断裂的是中间产物6-O-葡萄糖-环黄芪醇上C₆位置的β-葡萄糖苷键；

步骤C中β-葡萄糖苷酶的底物为6-O-葡萄糖-环黄芪醇，步骤C中得到的产物为环黄芪醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤C中的β-葡萄糖苷酶通过将β-葡萄糖苷酶基因导入大肠杆菌后诱导表达，再将菌体经超声破碎后而得到的粗酶液，每100mL的发酵菌液破碎后制得20mLβ-葡萄糖苷酶粗酶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤D中的水解液和水饱和正丁醇的体积比为1:0.5，萃取次数为三遍。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤D中的硅胶柱层析填料为100～200目硅胶粉。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤D中硅胶柱层析的洗脱剂为甲醇-氯仿-水的下层溶液，体积比为13:4:2。