[发明专利]一种利用两步酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法

说明书

本发明公开了一种利用两步酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。具体涉及一种以黄芪甲苷为底物，利用两种不同的水解酶分别水解断裂黄芪甲苷C₃位置的β‑木糖苷键和C₆位置的β‑葡萄糖苷键而得到黄芪甲苷的苷元环黄芪醇，后经萃取、硅胶柱层析以及乙醇重结晶纯化得到纯度95％以上的环黄芪醇产品。本发明解决了化学法制备环黄芪醇过程中黄芪甲苷的三元环结构的破坏而导致的大量副产物的产生的问题以及克服了传统环黄芪醇制备方法中底物转化率低、步骤繁琐、污染环境等不足。而本发明的优点在于底物特异性高，底物黄芪甲苷全部转化，步骤简单，条件温和，成本低，是温和的生物制备方法，对环境无污染，适合工业化生产。

技术领域

本发明属于医药化工领域，具体涉及一种利用两步酶解法转化黄芪甲苷

制备环黄芪醇的方法。

背景技术

黄芪甲苷是中药黄芪的主要活性成分，具有提高免疫力、清除自由基、降压、保肝利尿以及抗菌等多种功效。而环黄芪醇为黄芪皂苷的苷元，研究显示其具有抗氧化、能提高免疫力以及抵抗衰老等活性作用，且相比黄芪皂苷更易于肠道吸收以及膜渗透。另有研究显示，黄芪皂苷在体内发挥药物效果主要是通过被部分分解成环黄芪醇而起到作用。最重要的是环黄芪醇是目前世界上唯一已被证明的可以激活端粒酶活性的活性分子，能够有效抑制端粒的减少。

环黄芪醇(CA)：C₃₀H₅₀O₅、490.71、环黄芪醇黄芪皂苷的苷元，主要由黄芪甲苷水解得到，为无色针状结晶，易溶于甲醇、正丁醇等。环黄芪醇的化学结构式如下：

对于环黄芪醇的发现在1983年就有报道，它是大部分黄芪皂苷的苷元。目前主要通过化学法水解断裂黄芪甲苷(ASI)C₃位置的木糖苷键和C₆位置的葡萄糖苷键来得到环黄芪醇，但是由于黄芪甲苷上有一个三元环结构，这种结构不稳定，化学法水解过程中容易开环，形成副产物黄芪醇。

中国已公开的专利申请中(中国专利申请公开号：CN 104817610 A)使用硫酸酸解黄芪甲苷制备环黄芪醇，其水解温度为130℃，反应器采用一种高压反应釜。硫酸酸解反应条件剧烈，会导致黄芪甲苷的三元环严重破坏，产生大量的副产物。中国已公开的专利申请中(中国专利申请公开号：CN 103880910 A)采用一种氧化还原的方法制备环黄芪醇，理论上解决了三元环开环的问题，但是其操作步骤繁琐，而且强氧化剂和强还原剂的使用增加了对环境的污染以及生产成本，不易工业化生产。

另外中国已公开的两篇专利申请中(中国专利申请公开号：CN 105734109 A、CN105566434 A)均使用了多种水解酶复合的形式水解黄芪甲苷制备环黄芪醇，其中专利CN105734109 A中的复合酶为β-葡萄糖苷酶、蜗牛酶、柚苷酶、纤维素酶等酶按不同质量比的形式混合得来，而专利CN 105566434 A中的复合酶为β-葡萄糖苷酶、柚苷酶、β-木糖苷酶的组合。相较于本发明来说，复合酶的缺点无形中提高了酶成本，而且复合酶对底物黄芪甲苷的专一性差，黄芪甲苷的转化率较低。

发明内容

本发明选择采用一种两步酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇，采用这种温和的生物酶法制备环黄芪醇的目的在于：一、解决传统化学法制备过程中三元环易开裂形成副产物黄芪醇的问题。二、克服化学法制备环黄芪醇中操作步骤繁琐、生产成本高、污染环境、转化率低等缺点。三、较之一些使用复合酶酶解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，本发明提供了专一性非常高的水解酶，降低了生产成本，且本发明中的黄芪甲苷可以完全转化为环黄芪醇。本发明是根据现有技术的不足作出了创新和改进，提供一种高效的易工业化生产的生物酶法制备环黄芪醇的方法。

为实现上述发明目的，所采用的技术方案是：

A.酶解缓冲液的配制