[发明专利]一种纸基灵敏检测miRNA的方法

权利要求书

1.一种纸基灵敏检测miRNA的方法，其特征是包括以下步骤：

（1）制备所需要的试剂

焦炭酸二乙酯处理水成分是1 L 无菌水、1000 µL 焦炭酸二乙酯，经摇床过夜、次日高温高压灭菌30 min 得到；生长溶液是由667 µL 质量分数为1% 的氯金酸、1000 µL 焦炭酸二乙酯处理水、0.0139 g 盐酸羟胺组成；400 mL 探针DNA缓冲溶液成分是1.0412 g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、24.5 g 高氯酸钠，经焦炭酸二乙酯处理水稀释，浓盐酸调节PH到7得到；

（2）纳米金修饰纸芯片

将纳米金溶液滴加至纸芯片的工作区域，待其自然干燥后，重复滴加两次，将生长溶液滴加至纸芯片的工作区域，待其自然干燥后，重复滴加两次；

（3）巯基和纳米金形成金-硫键

纸芯片上滴加5 µL 10 nM 用亚甲基蓝标签标记巯基修饰的DNA发夹探针SH-CP-21，在黑暗环境下室温放置2 h，然后用20 µL 一倍的磷酸盐缓冲盐水洗，自然晾干；

（4）巯基乙醇的表面阻挡

纸芯片上滴加8 µL 巯基己醇自然晾干，最后用20 µL 一倍的磷酸盐缓冲盐水洗，自然晾干；

（5）放大和复用过程

取一定量的50 fM 目标分子miRNA-21、特异性双链核酸酶和特异性双链核酸酶缓冲液，使总体积为7 µL，搅拌离心混匀后滴加至纸芯片工作区域，孵育2 h；

（6）检测过程

将纸芯片置于适量探针DNA缓冲溶液中，用方波伏安法检测；方波伏安法检测的实验参数如下：初始电压为-0.5 V、终止电压为0.5 V、电位增量为0.004 V、振幅为0.025 V、频率为25赫兹、静置时间为2 S、灵敏度为10^-6 A/V。

2.根据权利要求1所述，一种纸基灵敏检测miRNA的方法，其特征在于，反应和检测过程都是在纸芯片上完成的，即采用特异性双链核酸酶在纸芯片上构建了miRNA的信号放大机制，通过电化学方法在纸芯片检测。

3.根据权利要求1所述，一种纸基灵敏检测miRNA的方法，其特征在于，试验中的目标物miRNA-21和DNA发夹探针SH-CP-21的核苷酸序列，它们的核苷酸序列为说明书核苷酸所述序列。