[发明专利]一种纸基灵敏检测miRNA的方法

说明书

技术领域

本专利公开了一种纸基灵敏检测miRNA的方法，涉及手绘纸电极方法和手动制作纸金电极方法和电化学检测技术领域，即在一张纸上利用蜡笔和铅笔通过手绘技术制作手绘纸电极再通过化学生长法，生长金纳米金，制作纸芯片，更确切的说采用特异性双链核酸酶（duplex specific nuclease，DSN）在纸芯片上构建了miRNA的信号放大机制，即目标miRNA与亚甲基蓝标签标记巯基修饰的DNA发夹探针SH-CP-21在纸芯片上形成DNA/RNA的杂交核酸双链，随后DSN切割RNA / DNA双链体的氧化还原标记的发夹探针，切割后带有标记发夹探针又会与目标miRNA杂交导致RNA / DNA双链体的形成，照此循环，再通过电化学方法检测。

背景技术

随着现在生活节奏的加快，不健康的饮食和无规律的作息时间等一系列坏习惯导致了人类患上了不同的疾病。癌症已经成为威胁人类健康的一大杀手，近年来其发病率及死亡率更是呈现逐步走高的趋势。研究发现，miRNA与癌症密切相关，可以作为癌症早期的检测标志物。它广泛存在于各种体液里，包括唾液、血浆、精液、眼泪和尿液等。而且癌症的发生与多种miRNA的变化密切相关，用单一miRNA的变化来说明癌症的发生存在很大的局限性。由几个miRNA同时变化造成，以miRNA等为代表的基因分析已成为临床诊断的理想生物标记。

miRNA是一类具有调节功能的非编码RNA，它通过调节信使RNA影响蛋白质的表达，长约为20-25个核苷酸。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。所以miRNA与癌症密切相关，可以作为癌症早期的检测标志物。

由于癌症的发生与多种miRNA的变化密切相关，用单一miRNA的变化来说明癌症的发生存在很大的局限性，而且体液中miRNA含量极低。所以同时检测多种miRNA和在miRNA含量很低时就能有效快速地检测出变得尤为重要。但是到目前为止，这个过程仍需要通过昂贵的实验室工作，使用显微镜和电脑芯片来实现，而且检测灵敏性低，这在很多经济不发达地区是不可能实现的，因此发明一种既能检测到低浓度又能降低miRNA检测成本的方法具有重要意义。一方面，DSN通过循环切割修饰在纸芯片上的目标miRNA与发夹探针形成DNA/RNA的杂交双链中的发夹探针，释放出目标miRNA，然后目标miRNA又会返回到下一轮反应，继续与有标记的发夹探针结合，DSN又会切割目标miRNA与发夹探针形成DNA/RNA的杂交双链中的有标记的发夹探针，照此，DSN通过多次循环切割修饰在纸芯片上的目标miRNA与发夹探针形成DNA/RNA的杂交双链中的有标记的发夹探针，发夹探针被DSN酶裂解成成千上万的探针分子从而使信号放大。解决高成本、灵敏性检测低问题。另一方面，电化学方法（方波伏安法）检测信号具有响应速度快、仪器成本低、检测灵敏度高等优势也可以很好地解决上述问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是昂贵的实验室工作和使用显微镜和电脑芯片来实现检测，而且检测灵敏性低。

一种纸基灵敏检测miRNA的方法，其特征是包括以下步骤：

（1）制备所需要的试剂

焦炭酸二乙酯处理水成分是1 L 无菌水、1000 µL 焦炭酸二乙酯，经摇床过夜、次日高温高压灭菌30 min 得到；生长溶液是由667 µL 质量分数为1% 的氯金酸、1000 µL 焦炭酸二乙酯处理水、0.0139 g 盐酸羟胺组成；400 mL 探针DNA缓冲溶液成分是1.0412 g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、24.5 g 高氯酸钠，经焦炭酸二乙酯处理水稀释，浓盐酸调节PH到7得到；

（2）纳米金修饰纸芯片

将纳米金溶液滴加至纸芯片的工作区域，待其自然干燥后，重复滴加两次，将生长溶液滴加至纸芯片的工作区域，待其自然干燥后，重复滴加两次；

（3）巯基和纳米金形成金-硫键

纸芯片上滴加5 µL 10 nM 用亚甲基蓝标签标记巯基修饰的DNA发夹探针SH-CP-21，在黑暗环境下室温放置2 h，然后用20 µL 一倍的磷酸盐缓冲盐水洗，自然晾干；

（4）巯基乙醇的表面阻挡

纸芯片上滴加8 µL 巯基己醇自然晾干，最后用20 µL 一倍的磷酸盐缓冲盐水洗，自然晾干；

（5）放大和复用过程