[发明专利]一种肺炎支原体恒温检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种核酸恒温扩增技术，尤其涉及一种不依赖于高能能量分子的用于检测肺炎支原体的恒温扩增技术及试剂盒。

背景技术

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）是引起人类呼吸道感染的重要致病菌之一，主要通过呼吸道飞沫以气溶胶微粒的形式传播。肺炎支原体大约每隔4-5年就会发生一次流行，以秋冬季发病为主，可引发非典型肺炎、支气管炎、气管炎等，最容易出现在处于婴幼儿时期和青少年期，发病率以青少年最高，有大约20%-25%的儿童肺炎和10%的成人肺炎是由肺炎支原体引起的，还会引发其他系统的肺外并发症，如心肌炎、肾炎、心包炎、脑干炎、脑膜炎等。

据统计，大约每年约10万成人因为感染肺炎支原体而住院治疗。肺炎支原体的临床症状不明显，甚至根本无症状，若有也只是头痛、咽痛、发热、咳嗽等一般的呼吸道症状，但也有个别死亡报道。因此，快速、准确诊断肺炎支原体感染对于治疗很重要。

目前由于治疗肺炎支原体的特效药物以及相关的预防疫苗还没有上市，所以即时检测及定期检测肺炎支原体具有预防和指导临床治疗的积极意义。常规的诊断方法有：ELISA法和分离培养法。ELISA法是一种将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术，其特异性强，因为抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间，而两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。但其干扰因素较多（如温度、时间），重复性不好；且容易受到自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性。分离培养法是最经典的诊断肺炎支原体的方法，但缺点在于操作时间长，需要配备专业技术人员在专业的实验室中进行检测，操作复杂，耗时长，无法做到现场即时检测，不适合临床样本的大批量处理及检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，主要解决现行技术操作复杂、耗时、技术要求高等问题。本发明试剂盒不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，仅需在恒温条件下即可进行核酸的扩增。

本发明所采取的技术方案是：一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，包括反应液、启动液、反应酶系、上游引物和下游引物。其特征在于：所述的反应酶系的成分包括单链结合蛋白、重组酶、肺炎支原体特异性引物（上游引物和下游引物）等，其中，重组酶为不依赖于能量分子的重组酶。

一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，其反应液成分包括：

Tris-缓冲液 20mM-100mM

KCl 20mM-80mM

(NH₄)₂SO₄0mM-100mM

甜菜碱0M-2M

Triton X-1000%-1%

PEG 1%-20%

DMSO0%-20%

BSA 0mg/mL-1mg/mL

优选的，Tris-缓冲液可选自Tris-H₂SO₄、Tris-乙酸、Tris-HCl中的任意一种或多种，Tris-缓冲液的pH为7.0～9.0。

一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，其特征在于：其启动液成分包括：

Mg²⁺ 5mM~20mM

优选的，Mg²⁺来自于硫酸镁、乙酸镁、氯化镁中的任意一种或多种。

一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，其反应酶系成分包括：

dNTPs 150uM-500uM

聚合酶Bsu 10-100U

单链结合蛋白200-700ng/ul

重组酶（E.coli RecT） 100-500ng/ul

上游引物100-300nM

下游引物100-300nM

聚合酶、单链结合蛋白和重组酶的用量可以根据需要调整其添加量，或通过预实验确定其用量。

优选的，一种肺炎支原体恒温检测试剂盒，其反应液具体组成成分如下：

Tris-HCl（pH=8.3）50mM

KCl 60mM

(NH₄)₂SO₄10mM

甜菜碱1M

Triton X-1000.1%

PEG 5%

DMSO6%

BSA 0.1mg/mL 。